背景[1-6]
凝膠阻滯遷移電泳檢測服務（EMSA）是一種研究DNA/RNA結合蛋白和其相關的DNA/RNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。依據(jù)實驗需要，設計標記探針、非標記探針、蛋白特異性抗體等參照物，基于DNA-蛋白質或RNA-蛋白質復合體在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）中有不同遷移率的原理，當轉錄因子與特異的DNA或RNA結合后，其在PAGE中的遷移率將小于未結合核蛋白轉錄因子的DNA，從而檢測到活化的與DNA或RNA結合的蛋白轉錄或調節(jié)因子。
EMSA是目前研究核酸與蛋白質相互作用的一種重要實驗手段，凝膠阻滯遷移電泳檢測常用于轉錄因子與啟動子相互作用的驗證性實驗。該實驗利用核酸與蛋白結合后，在非變性聚丙烯酰氨凝膠中電泳的遷移速率會明顯降低的原理，通過設計特異性和非特異性的探針，通過孵育與目標蛋白結合，形成探針-蛋白復合體，由于分子量變大，在聚丙烯酰氨凝膠中的電泳遷移速率下降，相比于未結合的探針會出現(xiàn)滯后效應，再通過探針上特殊的標記物性質，通過轉膜、顯色或曝光，探針-蛋白復合體所在的位置便能形成條帶，從而證明核酸與蛋白的相互作用。
目前隨著實驗技術的改進，能夠定性和定量的完成實驗。這一技術最初用于研究DNA結合蛋白，目前也廣泛用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。
當檢測如轉錄調控因子一類的DNA結合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時，依據(jù)目的RNA結合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質細胞抽提液。反應體系中常加入隨機打斷的鮭魚精DNA或polydI-dC來防止非特異性競爭；亦可以添加未標記的DNA或RNA探針，進行特異性競爭實驗以確定該結合是特異性的。
應用[7][8]
凝膠阻滯遷移電泳檢測服務（EMSA）可用于蛋白分子機制研究：
在小鼠植入前胚胎中轉錄因子Oct4對Dnmt1啟動子調控的分子機制研究中使用昆明白小鼠作為實驗材料,通過定量PCR研究小鼠各植入前胚胎中Dnmt1的表達,將結果與已報導的Oct4表達水平進行比較,發(fā)現(xiàn)Dnmt1呈現(xiàn)出相反的表達模式。
通過啟動子分析研究轉錄因子Oct4對小鼠Dnmt1啟動子活性的影響,我們首先擴增出4條小鼠Dnmt1啟動子5’端缺失片段,然后將缺失片段分別與pGL3-Basic載體連接形成重組質粒,將含有小鼠Oct4基因的真核表達重組質粒Oct4-pcDNA3.1與小鼠Dnmt1基因啟動子5’端缺失片段-pGL3-Basic重組質粒共轉染到NIH/3T3細胞系,通過檢測熒光素酶活性發(fā)現(xiàn),當轉錄起始位點上游-554-294bp區(qū)域缺失后,轉錄因子Oct4會抑制小鼠Dnmt1基因啟動子活性。
通過免疫共沉淀及凝膠阻滯遷移實驗分別在體內(nèi)和體外進行研究,證實了轉錄因子Oct4在小鼠Dnm t1基因啟動子上的結合區(qū)域。通過在NCI-H157細胞中過表達Oct4進一步說明轉錄因子Oct4能夠促進Dnmt1的表以及增強IDNA轉移酶1的活力。
研究表明,DNA甲基化、非編碼RNA、組蛋白修飾、染色質重塑等都屬于表觀遺傳修飾機制。在眾多的表觀遺傳修飾模式中,DNA甲基化是研究的最為廣泛也是最充分的表觀遺傳修飾模式。在胚胎發(fā)育的過程中,全基因組范圍內(nèi)DNA甲基化模式的改變和維持是通過DNA甲基化轉移酶進行的。Oct4也是胚胎發(fā)育過程中至關重要的基因。
之前的研究表明,轉錄因子Oct4在小鼠植入前胚胎發(fā)育過程中起著重要的調節(jié)作用,轉錄因子Oct4能夠結合到胚胎發(fā)育相關基因的啟動子上,通過調控基因的轉錄及功能,從而進一步影響小鼠植入前胚胎的發(fā)育。轉錄因子Oct4能夠影響Dnmt1的表達,從而可能進一步影響全基因組范圍內(nèi)的DNA甲基化模式。在哺乳動物早期胚胎發(fā)育階段,轉錄因子Oct4以及其他胚胎發(fā)育相關的基因能夠通過影響Dnmt1的表達,從而影響DNA甲基化模式。
參考文獻
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[8]張遠.小鼠植入前胚胎中轉錄因子Oct4對Dnmt1啟動子調控的分子機制研究[D].安徽農(nóng)業(yè)大學,2014.