背景^[1-7]

Pull Down實(shí)驗(yàn)服務(wù)是在體外條件下檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用的方法。通過(guò)SDS-page電泳分析，或結(jié)合WB和MS檢測(cè)，可驗(yàn)證蛋白間的相互作用或篩選獲取相應(yīng)的目的蛋白。GST-pull-down是體外驗(yàn)證/尋找互作蛋白的技術(shù)，大多采用標(biāo)簽（如GST）抗體來(lái)檢測(cè)，因此適用范圍廣。Pull-down技術(shù)與Co-IP非常相似，只不過(guò)后者是用抗體交聯(lián)磁珠或agarose，pull-down是用固相化的、已標(biāo)記的餌蛋白或標(biāo)簽蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），從細(xì)胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白（對(duì)混合液中的所有蛋白）。

通過(guò)Pull-down技術(shù)可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關(guān)蛋白間的相互作用關(guān)系，從體外轉(zhuǎn)錄或翻譯體系中檢測(cè)出蛋白相互作用關(guān)系。聯(lián)用高分辨率質(zhì)譜對(duì)pull-down拉下來(lái)的蛋白復(fù)合物進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，就能檢測(cè)出與靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。在Pull down實(shí)驗(yàn)中，帶有標(biāo)簽的誘餌蛋白被特異結(jié)合該標(biāo)簽的固相化親和配基捕獲，產(chǎn)生“次級(jí)親和支持物”，用于純化與誘餌蛋白相互作用的其他蛋白。

固相化誘餌蛋白的次級(jí)親和支持物可以與含有推測(cè)獵物蛋白的各種蛋白樣品相互孵育，如果緩沖液及樣品條件與靶結(jié)合相互作用兼容，且誘餌蛋白在帶有標(biāo)簽和被固相化時(shí)仍然可以行使功能，那么存在于樣品中的獵物蛋白就會(huì)結(jié)合到親和支持物上，“誘餌-獵物復(fù)合體”可從支持物上洗脫下來(lái)。

服務(wù)流程：

1.構(gòu)建帶標(biāo)簽的誘餌蛋白原核表達(dá)載體（帶his或GST標(biāo)簽）；

2.載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)誘餌蛋白（這一步比較關(guān)鍵，很多蛋白原核表達(dá)會(huì)形成包涵體，極大影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，我們采用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌，使得包涵體形成的幾率大大降低）；

3.細(xì)菌裂解液過(guò)柱子，帶標(biāo)簽的誘餌蛋白被特異結(jié)合標(biāo)簽的固相化親和配基捕獲，產(chǎn)生“次級(jí)親和支持物”；

4.待測(cè)樣品裂解液過(guò)柱子孵育，與誘餌蛋白互作的蛋白被“次級(jí)親和支持物”吸附；

5.清洗，離心，去除未結(jié)合的雜蛋白；

6.洗脫，得到誘餌蛋白及其互作蛋白的復(fù)合物；

7.如要驗(yàn)證某個(gè)蛋白X與誘餌蛋白互作，則將6.所得的蛋白復(fù)合物與X蛋白的抗體孵育，做Western blot驗(yàn)證；

8.如要尋找誘餌蛋白可能的互作蛋白，則將6.所得的蛋白復(fù)合物進(jìn)行LC-MS/MS鑒定；

應(yīng)用^[8][9]

Pull Down實(shí)驗(yàn)服務(wù)可用于篩查PAD4相互作用蛋白：

PAD4也可以作為共抑制因子下調(diào)抗癌基因P53誘導(dǎo)的下游基因的表達(dá)，被認(rèn)為參與了腫瘤的發(fā)生，但具體作用機(jī)制尚不清楚；PAD4主要在免疫細(xì)胞中表達(dá)，是五種肽酰基精氨酸脫亞胺酶中唯一具有核定位信號(hào)的蛋白多肽瓜氨酸化酶。實(shí)驗(yàn)室通過(guò)蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn)TNF-α有誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞中PAD4蛋白核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，PAD4蛋白核轉(zhuǎn)移后分子量變大，推測(cè)入核過(guò)程中可能與其他蛋白發(fā)生相互作用。

明確其核轉(zhuǎn)移時(shí)相互作用蛋白及闡明其核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，對(duì)于認(rèn)識(shí)PAD4在正常生理狀態(tài)和病變情況下的基因功能具有重要的意義。構(gòu)建GST-PAD4載體及核定位信號(hào)缺失載體GST-PAD4-NLS-，通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件得到高純度融合蛋白GST-PAD4及GST-PAD4-NLS-，用GST pull-down assay初步尋找PAD4核轉(zhuǎn)移時(shí)與之相互作用的蛋白。

方法：用TNF-α處理HL-60細(xì)胞，蛋白免疫印跡觀察PAD4在HL-60細(xì)胞中核轉(zhuǎn)移，然后構(gòu)建帶有GST標(biāo)簽的PAD4以及PAD4核定位信號(hào)缺失（PAD4-NLS-）的原核表達(dá)載體；通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，獲得重組蛋白表達(dá)的工程菌，經(jīng)過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，獲得重組蛋白的可溶性表達(dá)；再利用Sepharose4B親和層析法分別純化出重組蛋白GST-PAD4以及GST-PAD4-NLS-，將純化的重組蛋白分別固定在谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Sepharose4B)上，與來(lái)源于HL-60細(xì)胞中的總蛋白共同孵育，富集可能與GST-PAD4以及GST-PAD4-NLS-發(fā)生相互作用的蛋白；最后經(jīng)SDS-PAGE聯(lián)合銀染初步尋找可能與PAD4或PAD4-NLS-發(fā)生相互作用的蛋白。

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