背景^[1-7]

免疫共沉淀檢測服務(wù)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的，用于研究蛋白質(zhì)相互作用的基本方法。原理是以細胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，將靶蛋白抗體與細胞總蛋白進行共孵育，促進免疫復(fù)合物的形成。隨后加入能夠與靶蛋白抗體結(jié)合的protein A/G，形成“結(jié)合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗體”復(fù)合物。免疫復(fù)合物經(jīng)純化后進行凝膠電泳分離，結(jié)合Western blot或質(zhì)譜技術(shù)，進而達到純化目的蛋白質(zhì)、定性檢測抗原或抗體的目的。

與其它研究方法相比，免疫共沉淀在生理條件下檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用，因此，不僅可以檢測到體內(nèi)形成的天然復(fù)合體，而且可排除過表達靶蛋白所帶來的假陽性。其次內(nèi)源性的靶蛋白質(zhì)是完全加工、修飾和成熟的蛋白質(zhì)，因此，依賴于修飾的蛋白質(zhì)相互作用也能被檢測到。染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，利用該技術(shù)不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾以及轉(zhuǎn)錄因子與基因表達的關(guān)系。免疫共沉淀（Co-IP）是以研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，其原理基礎(chǔ)為抗體-抗原之間的專一性作用。

在分子病理生物學(xué)研究領(lǐng)域，Co-IP是用以確定兩種蛋白在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的常用方法。其技術(shù)原理為：當(dāng)細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來，如果用蛋白質(zhì)N的抗體免疫沉淀N，那么與N在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)M也能沉淀下來。目前多用于精制的蛋白A預(yù)先結(jié)合固化在瓊脂糖的珠子（Beads）上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的蛋白A就能吸附抗原到精制的目的。Co-IP主要用于測定兩種目標蛋白質(zhì)在體內(nèi)的結(jié)合情況，也用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的結(jié)合蛋白。

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的原理是：在生理狀態(tài)下把細胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化及鑒定。

服務(wù)內(nèi)容

1.標簽蛋白的免疫共沉淀(Myc-tag,Flag-tag,HA-tag)

2.非標簽蛋白的免疫共沉淀(Native protein)

3.染色質(zhì)免疫共沉淀（Chip-IP）

技術(shù)流程

1.構(gòu)建相關(guān)真核表達載體，轉(zhuǎn)染細胞并獲得表達；

2.蛋白質(zhì)抽提與定量；

3.免疫沉淀（以normal IgG作為對照）；

4.免疫沉淀產(chǎn)物SDS-PAGE和western blot分析；

5.完整技術(shù)服務(wù)實驗報告提交。

應(yīng)用^[8]

免疫共沉淀檢測服務(wù)可用于篩選研究蛋白之間的相互作用：

篩選細胞內(nèi)與A型流感病毒M2蛋白(A/M2)相互作用的蛋白質(zhì)。將A/M2編碼序列插入真核表達載體pCAGGS-CFlag,重組質(zhì)粒pCAGGS-CFlag-A/M2轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞,裂解細胞,以Flag單抗偶聯(lián)的瓊脂糖球珠免疫沉淀A/M2-Flag蛋白,清洗去除非特異性結(jié)合的雜蛋白后,SDS-PAGE銀染法顯示與A/M2共沉淀的蛋白,從膠上切下此蛋白條帶進行質(zhì)譜分析。

構(gòu)建了A/M2的表達質(zhì)粒,免疫印跡證實了A/M2蛋白在293T細胞中能夠表達,免疫共沉淀篩選到與A/M2結(jié)合的多種蛋白,分析質(zhì)譜結(jié)果,確定ataxin 10和3個真核翻譯起始因子(eIF)為候選蛋白。ataxin 10與A/M2相互作用為流感病毒感染或接種流感疫苗引發(fā)小腦性共濟失調(diào)提供了解釋,eIF與A/M2相互作用表明A/M2可能在調(diào)控病毒蛋白合成方面起重要作用。

參考文獻

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[5]Influenza virus M2 integral membrane protein is a homotetramer stabilized by formation of disulfide bond.Holsinger L J,Lamb R A.Journal of Virology.1991

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