背景^[1-6]

gRNA文庫(kù)構(gòu)建基本原理是通過(guò)一段與靶標(biāo)DNA相同的gRNA指導(dǎo)Cas9核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行DNA修飾，以此造成基因的功能突變或缺失。在此基礎(chǔ)上，利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立哺乳動(dòng)物全基因組突變庫(kù)或者與某類功能相關(guān)的基因突變體庫(kù)，通過(guò)功能性篩選和富集以及隨后的PCR擴(kuò)增和深度測(cè)序分析，發(fā)掘與篩選表型相關(guān)的基因，稱為CRISPR/Cas9 gRNA文庫(kù)篩選。

gRNA文庫(kù)是藥物篩選或靶向篩選特定通路的理想工具，gRNA文庫(kù)的建立將在功能基因篩選、疾病機(jī)制研究及藥物研發(fā)等方面發(fā)揮重要的功能。gRNA文庫(kù)包括：全基因組文庫(kù)、lncRNA文庫(kù)、信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、離子通道、核受體相關(guān)、各種疾病相關(guān)等文庫(kù)。全基因組gRNA文庫(kù)的構(gòu)建可以針對(duì)任何類型的基因組DNA，包括ORF cDNA，lncRNA cDNA以及特定區(qū)域的cDNA片段等。能夠針對(duì)全長(zhǎng)cDNA乃至基因組DNA構(gòu)建高效的gRNA文庫(kù)，適用于高通量功能基因及相關(guān)藥物靶點(diǎn)篩選。

CRlSPR/Cas9 gRNA文庫(kù)篩選大體流程分為五步，即gRNA文庫(kù)選擇，gRNA文庫(kù)擴(kuò)增，gRNA文庫(kù)慢病毒包裝，gRNA文庫(kù)篩選，PCR擴(kuò)增和NGS測(cè)序。

1、gRNA文庫(kù)選擇

首先客戶選擇所需gRNA文庫(kù)。如果客戶根據(jù)具體需要提出文庫(kù)定制（小于300個(gè)基因），我們將根據(jù)客戶提供的基因群信息進(jìn)行單個(gè)基因的gRNA設(shè)計(jì)，保證每個(gè)基因設(shè)計(jì)3個(gè)不同的gRNA，程度確保基因功能的突變。采用的載體是單/雙慢病毒載體，單慢病毒載體是一個(gè)載體上同時(shí)攜帶單個(gè)gRNA和cas9基因，雙慢病毒載體是一個(gè)載體上只有單個(gè)gRNA，cas9蛋白則由單獨(dú)攜帶cas9的載體提供。這兩種模式載體均攜帶有額外的抗性篩選標(biāo)記。

2、gRNA文庫(kù)擴(kuò)增

上述構(gòu)建的載體數(shù)量較少，不足以進(jìn)行文庫(kù)的慢病毒包裝和使用。因此，需要對(duì)上述載體進(jìn)行擴(kuò)增，增加總量。上述gRNA載體構(gòu)建完成后，我們將這些載體按相同的比例混合成一個(gè)pool（即載體混合庫(kù)），隨后將載體混合庫(kù)使用專用電轉(zhuǎn)感受態(tài)，電轉(zhuǎn)擴(kuò)增培養(yǎng)并收集菌落，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，最后抽提質(zhì)粒，即得到了擴(kuò)增后的載體混合庫(kù)，也就是文庫(kù)。

3、gRNA文庫(kù)慢病毒包裝

擴(kuò)增后的gRNA文庫(kù)在慢病毒包裝載體的輔助下轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒的包裝。由于gRNA文庫(kù)是由多個(gè)不同的gRNA載體混合而成，因此獲得的慢病毒是混合型病毒庫(kù)，每個(gè)病毒攜帶單個(gè)gRNA載體。

4、gRNA文庫(kù)篩選

對(duì)篩選的目的細(xì)胞進(jìn)行病毒感染預(yù)實(shí)驗(yàn)，得到細(xì)胞在較低的MOI時(shí)感染百分?jǐn)?shù)，以確認(rèn)感染時(shí)gRNA文庫(kù)的病毒用量。慢病毒庫(kù)以較低的MOI值感染細(xì)胞（確保每個(gè)細(xì)胞最多進(jìn)入一個(gè)慢病毒），隨后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩鴮?duì)細(xì)胞采用相應(yīng)的處理，最后經(jīng)過(guò)不同的篩選方式富集細(xì)胞。以耐藥性基因篩選實(shí)驗(yàn)為例，根據(jù)前期藥物IC50實(shí)驗(yàn)，得到藥物篩選實(shí)驗(yàn)的處理濃度。采用高濃度藥物處理感染后的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選后存活的細(xì)胞則具有一定的耐藥性，將此群細(xì)胞擴(kuò)增并收集下來(lái)，耐藥性的來(lái)源是CRlSPR/Cas9 gRNA對(duì)相應(yīng)基因的修飾。

5、PCR擴(kuò)增和NGS測(cè)序

對(duì)步驟4篩選中富集下來(lái)的細(xì)胞進(jìn)行慢病毒載體的PCR擴(kuò)增，該擴(kuò)增片段包含載體所攜帶的gRNA序列，通過(guò)后續(xù)的NGS測(cè)序，可以得到富集細(xì)胞中g(shù)RNA的富集度，從而尋找到相應(yīng)的基因，這些基因很有可能參與藥物作用過(guò)程，因此可作為深入研究的待選基因。

應(yīng)用^[7][8]

gRNA文庫(kù)構(gòu)建的流程可用于通路或疾病相關(guān)基因的篩選：

在利用CRISP/Cas9技術(shù)敲除C57BL/6小鼠中的RelB基因,為核因子(nuclear factor,NF)-κB轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族的RelB基因與腫瘤轉(zhuǎn)移等方面的研究提供RelB基因敲除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。方法:利用基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng),設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)目的基因RelB第4外顯子sgRNA,同時(shí)利用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄Cas9 mRNA。取C57BL/6小鼠受精卵體外注射sgRNA和Cas9 mRNA后,進(jìn)行胚胎移植,實(shí)現(xiàn)靶基因敲除。

待小鼠出生后提取DNA并進(jìn)行PCR鑒定,獲得F0代,后與野生型交配后繁殖,取樣提取DNA,測(cè)序分析鑒定后獲得F1代小鼠,并在蛋白質(zhì)水平和基因組水平分別驗(yàn)證敲除效果。結(jié)果:獲得了4個(gè)在RelB基因突變的首建鼠,并得到了穩(wěn)定遺傳的RelB基因敲除小鼠。基因組測(cè)序結(jié)果示,敲除實(shí)驗(yàn)組中RelB的mRNA出現(xiàn)無(wú)義突變,令其mRNA翻譯終止。與對(duì)照組相比,敲除實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)不到RelB蛋白表達(dá)。同時(shí),Western blot結(jié)果顯示,NF-κB家族中其他成員RelA、p50和p52的蛋白表達(dá)不受影響。

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