介紹
(R)-3-氨基丁酸，也稱為(R)-β-氨基丁酸或(R)-Baclofen，是一種非蛋白氨基酸，分子式為C4H9NO2，分子量為103.12 g/mol，CAS號為367-60-2。外觀為白色結(jié)晶性粉末。它在水中溶解度較低，可溶于堿性溶液。熔點(diǎn)約在230°C左右。它具有光學(xué)活性，是手性分子的R型。
(R)-3-氨基丁酸
用途
(R)-3-氨基丁酸，即(R)-Baclofen，是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)的衍生物，作為GABA-B受體的特異性激動劑，它能夠模擬GABA的作用，通過結(jié)合GABA-B受體產(chǎn)生抑制性神經(jīng)傳遞效應(yīng)，從而減少神經(jīng)元的興奮性。它主要用于治療由多種原因引起的肌肉痙攣，如多發(fā)性硬化癥、脊髓損傷、腦損傷或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病，也用于減輕肌肉緊張和僵硬，改善肌肉的運(yùn)動功能。
合成
存在的問題
目前(R)?3?氨基丁酸的制備方法主要有化學(xué)合成法和酶催化法?；瘜W(xué)合成包括如：利用乙酰乙酸乙酯為原料，與乙酰胺縮合，經(jīng)不對稱氫化，經(jīng)水解得到(R)?3?氨基丁酸的方法。最幾年來，隨著市場對(R)?3?氨基丁酸的需求越來越大，出于降低成本，減少污染的要求，利用酶法催化生產(chǎn)(R)?3?氨基丁酸的報道逐漸增多?，F(xiàn)有技術(shù)中，利用酶法催化制備(R)?3?氨基丁酸普遍存在兩個問題：1)酶催化方法制備(R)?3?氨基丁酸，通常需要添加銨鹽來提高轉(zhuǎn)化率，銨鹽的添加會增加后期(R)?3?氨基丁酸的制備提純復(fù)雜性；2)提純(R)?3?氨基丁酸多采用微濾、超濾、納濾等膜處理的方法來對催化反應(yīng)體系進(jìn)行預(yù)處理，但是膜處理生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)液極易造成堵塞及膜污染的現(xiàn)象，影響效率。
新合成方法
氨基轉(zhuǎn)移酶工程菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)制備(R)-3-氨基丁酸，具體分為以下四個步驟[1]：
1)氨基轉(zhuǎn)移酶工程菌的種子液的培養(yǎng)
取實(shí)施例1制備得到的基因工程菌BL21(DE3)[p ET30?AT]，將其接種于培養(yǎng)皿平板上活化菌種，培養(yǎng)時間14h；從平板上挑取單菌落接種至LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na Cl 10g/L)，在37℃、180rpm的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16h得到發(fā)酵的種子培養(yǎng)液。
2)氨基轉(zhuǎn)移酶工程菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)
采用5L發(fā)酵罐進(jìn)行氨基轉(zhuǎn)移酶高密度細(xì)胞發(fā)酵，裝液量為2.5L。將步驟1)培養(yǎng)得到的種子液按10％的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中(蛋白胨30g/L，酵母粉30g/L，甘油50g/L，Na2HPO4 16.4g/L，KH2PO4 8g/L，無水硫酸鎂0.6g/L，Na Cl 10g/L)，溫度控制在37℃，轉(zhuǎn)速，通氣聯(lián)動保持溶氧控制在25％，自動流加氨水保持p H值控制在6 .5?7 .5。發(fā)酵約8h后，當(dāng)OD600為25時，開始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基(甘油50％(v/v)，蛋白胨40g/L，酵母粉40g/L)，流加速率為40m L/h；當(dāng)培養(yǎng)約12h，OD600為45時，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度至28℃，加入0.5m M IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，共誘導(dǎo)7h(每隔1h進(jìn)行取樣，用于后續(xù)蛋白表達(dá)量分析)；約18h的發(fā)酵結(jié)束后，菌體OD600最后為72.6，所得菌體濕重為3.5g/OD600/L。菌體發(fā)酵時間與OD600之間的關(guān)系如圖2所示，誘導(dǎo)時間與蛋白表達(dá)量的關(guān)系如圖3所示。根據(jù)圖3，隨著誘導(dǎo)表達(dá)的進(jìn)行，氨基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量顯著提升。
3）當(dāng)上一步的高密度發(fā)酵結(jié)束后，離心收集菌體作為全細(xì)胞催化劑。配制生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)液：向水中加入上一步發(fā)酵后獲得的菌體，添加量為按照菌體濕重50g/L，加入200g/L巴豆酸，用氨水調(diào)節(jié)p H至9.0，水定容至1000ml。在45℃條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。中間過程間隔取樣檢測底物與產(chǎn)物的反應(yīng)情況，9h后，底物完全轉(zhuǎn)化完畢，上清液中(R)?3?氨基丁酸濃度為227g/L，轉(zhuǎn)化率為95%。
參考文獻(xiàn)
[1]王昭凱,胡凡,楊隆河. 一種(R)-3-氨基丁酸的合成與純化方法[P]. 福建?。篊N202110882949.9,2022-11-04.