肌酸激酶（EC2.7.3.2）通常存在于動(dòng)物的心臟、肌肉以及腦等組織的細(xì)胞漿和線粒體中，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)。在磷酸肌酸合成途徑中起到可逆催化肌酸形成磷酸肌酸的作用，正反應(yīng)過(guò)程中需要ATP提供磷?；?，磷酸肌酸含有高能鍵，具有儲(chǔ)能作用，因此可以補(bǔ)償機(jī)體ATP的濃度。

磷酸肌酸，在肌肉或其他可興奮性組織（如腦和神經(jīng)）中的一種高能磷酸化合物，是高能磷酸基的暫時(shí)貯存形式，其可以作為心肌細(xì)胞保護(hù)劑和能量供給物，用于臨床手術(shù)和心肌缺血等輔助性治療，效果好，安全性高，社會(huì)需求大。目前在磷酸肌酸的生產(chǎn)技術(shù)中，生物酶法合成技術(shù)由于其具有無(wú)環(huán)境污染，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快和專(zhuān)一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為了磷酸肌酸生產(chǎn)工業(yè)的研究重點(diǎn)。

生產(chǎn)工藝

生物酶法生產(chǎn)磷酸肌酸工藝中，技術(shù)的關(guān)鍵在于肌酸激酶的使用。目前，用于此酶的生產(chǎn)提取難以規(guī)模化，酶利用效率低等原因?qū)е铝姿峒∷嵘a(chǎn)成本過(guò)高，因而此技術(shù)一直沒(méi)有得到產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)，因此尋找一種催化性能高度優(yōu)化的肌酸激酶尤為重要。

本發(fā)明提出一種改造肌酸激酶的方法，以使此酶更適用于磷酸肌酸工業(yè)生產(chǎn)的需求。它能夠進(jìn)一步提高酶法生產(chǎn)磷酸肌酸工藝中肌酸激酶的催化能力，進(jìn)而提高磷酸肌酸生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，從而為酶法生產(chǎn)磷酸肌酸工業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明的技術(shù)方案為利用基因工程技術(shù)，將兔肌肌酸激酶在基因?qū)用嫔蠈?duì)一些功能位點(diǎn)進(jìn)行一系列的突變，以期從中篩選到性能進(jìn)一步改善的肌酸激酶，如改善酶熱穩(wěn)定性，酶催化能力，耐堿性等，以便適用于磷酸肌酸酶法生產(chǎn)中的條件需求。

利用基因工程手段對(duì)肌酸激酶進(jìn)行突變的詳細(xì)過(guò)程為：

（1）以兔肌肉型的肌酸激酶（GeneBank:NW_003159633.1，25315-33102）為基礎(chǔ)，對(duì)其進(jìn)行一系列的突變，并人工合成突變肌酸激酶基因序列。其突變位點(diǎn)發(fā)生在PRO66、CYS146、TRP210、GLY268和HIS295其中一個(gè)至三個(gè)氨基酸殘基上，相應(yīng)替換為SER、ASN、THR和ALA其中一個(gè)至三個(gè)氨基酸殘基。

（2）構(gòu)建含有突變序列的克隆載體，所述克隆載體為pUC19；構(gòu)建含有突變序列的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體為pET21、pET15或pET28。

（3）轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行克隆和高效表達(dá)。所述克隆大腸桿菌為DH5α或Top10，所述表達(dá)型大腸桿菌為BL21（DE3）。

（4）將發(fā)酵菌液通過(guò)高壓勻漿法等物理手段進(jìn)行破碎，離心，利用乙醇沉淀法進(jìn)行純化。此步可去除80%以上的雜蛋白，且所得到的肌酸激酶依然保持高活性，可以滿(mǎn)足酶固定化的需求，且純化的成本亦在可接受的范圍內(nèi)。

本發(fā)明提供了一種可以應(yīng)用于肌酸激酶酶法工業(yè)生產(chǎn)的酶催化劑突變改造類(lèi)型，大大提高了酶催化反應(yīng)效率，降低了生產(chǎn)成本。這些優(yōu)點(diǎn)都為本發(fā)明改造的肌酸激酶能夠廣泛應(yīng)用于磷酸肌酸酶法工業(yè)生產(chǎn)中提供了保障。

參考文獻(xiàn)

CN104357420A