D-(+)-蘋果酸，又稱羥基丁二酸或羥基琥珀酸，是自然界中存在稀少的一種有機(jī)酸，主要應(yīng)用于手性藥物合成、手型添加劑和手型助劑等領(lǐng)域，例如抗生素、抗病毒藥物、抗癌藥物、D-或L-肉毒堿和維生素(R)-泛酸等合成中的應(yīng)用，也可作為配體合成藥物拆分劑。本文將介紹一種利用生物酶法合成D-(+)-蘋果酸的方法^[1]。

背景技術(shù)

目前合成D-(+)-蘋果酸的方法主要有化學(xué)拆分法、生物酶拆分法和生物酶法。其中，化學(xué)拆分法合成D-(+)-蘋果酸的成本高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；生物酶拆分法合成D-蘋果酸的生產(chǎn)濃度很低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)化要求；生物酶法轉(zhuǎn)化合成D-蘋果酸的研究報(bào)道最經(jīng)濟(jì)的，路線是從馬來(lái)酸轉(zhuǎn)化合成D-蘋果酸。然而應(yīng)用這些從自然環(huán)境中篩選的微生物進(jìn)行生物酶法合成D-蘋果酸時(shí)，菌種發(fā)酵生物量非常低，最高OD660有4.5，嚴(yán)重制約著工業(yè)化生產(chǎn)。

合成步驟

A.利用大腸桿菌Rosetta(DE3)作為宿主菌，共表達(dá)來(lái)源于產(chǎn)堿假單胞菌的馬來(lái)酸水合酶的大小亞基PaHbzI和PaHbzJ，獲得共表達(dá)馬來(lái)酸水合酶大小亞基PaHbzI和PaHbzJ的大腸桿菌工程菌pETDuet-PahbzI-PahbzJ/Rosetta(DE3)，即DHIJ工程菌；

B.通過(guò)生物發(fā)酵DHIJ工程菌獲得大量表達(dá)馬來(lái)酸水合酶大小亞基的濕菌體，再利用濕菌體全細(xì)胞轉(zhuǎn)化馬來(lái)酸合成D-(+)-蘋果酸。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

此方法所構(gòu)建工程菌DHIJ穩(wěn)定性好，易于培養(yǎng)，發(fā)酵周期短(18-20小時(shí))，比已知用于酶法合成D-蘋果酸的菌種發(fā)酵時(shí)間短接近10小時(shí)；發(fā)酵生物量高(120-140g/L，OD600為60-70)，比目前報(bào)道的用于酶法合成D-(+)-蘋果酸的菌種發(fā)酵生物量最高OD616為4.5高太多，大大節(jié)約了發(fā)酵成本。

采用“一鍋法”進(jìn)行生物酶法合成D-(+)-蘋果酸的工藝簡(jiǎn)單，易于操作，轉(zhuǎn)化周期短(16小時(shí)內(nèi))，比目前報(bào)道的轉(zhuǎn)化時(shí)間短10小時(shí)，節(jié)約大量人力和電力。

參考文獻(xiàn)

[1] 一種生物酶法合成d-蘋果酸的方法. Patent No. CN109402184A