背景及概述^[1-2]

上皮細胞覆蓋于身體表面并襯貼于體內(nèi)空腔器官腔面的細胞。其排列有明顯極性，一面朝向身體表面或腔面，稱游離面；一面向著深部的結(jié)締組織，稱基底面。上皮細胞具有強大的角生和更新能力。上皮組織具有保護、吸收、分泌和排泄等作用。當上皮細胞受損時，則影響機體的防御功能。子宮組織由上皮細胞、基質(zhì)細胞以及平滑肌細胞組成，是雌性哺乳動物孕育胎兒的器官，在生殖活動中占有重要地位，體外培養(yǎng)的子宮細胞可以作為胚胎和胚胎干細胞系的飼養(yǎng)層。隨著組織工程學的發(fā)展，體外構(gòu)建組織工程化子宮片層已成為現(xiàn)實，為進一步研究子宮疾病和胚胎著床提供了更理想的實驗?zāi)Ｐ?。而以上研究均需要大量的、高純度的子宮細胞，國內(nèi)外學者對子宮細胞的分離、培養(yǎng)方法進行了大量研究。1989年根據(jù)細胞沉降速度不同分離得到子宮細胞；采用74μm(200目)和35μm(350目)的濾網(wǎng)過濾2次，獲得純度較高的人子宮細胞；將懸浮的子宮內(nèi)膜細胞吸附在用抗體包被的免疫磁珠上，也成功分離了子宮細胞，但以上方法均有不足。小鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞采用先膠原酶消化、后組織貼塊法，結(jié)合上皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細胞總量約為5×10^5cells/瓶；細胞經(jīng)Cytokeratin-19/PCK免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

分離和原代培養(yǎng)　^[2]

(1)頸部脫臼法處死妊娠第4天(d4)的孕鼠，在無菌條件下摘取小鼠的子宮；(2)在超凈工作臺上將子宮組織在無鈣、鎂的0.01MPBS中洗去血塊和黏液，在低倍解剖鏡下用眼科剪去除組織周圍的脂肪塊和血管；(3)在解剖鏡下沿子宮腔將其縱向切開，內(nèi)膜面朝上展平于培養(yǎng)皿中。加入1g/LⅠ型膠原酶消化液，37℃消化30min，其間可振蕩數(shù)次；(4)消化結(jié)束后輕輕吹打組織塊，挑出大塊組織，按10%的濃度加入胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)或培養(yǎng)液終止消化，將消化后的細胞懸液經(jīng)150μm篩網(wǎng)過濾，除去黏液和未消化的組織，將消化液轉(zhuǎn)移至含10mLPBS的離心管中靜置10min；(5)棄去上層液，下層液500×g離心10min；離心結(jié)束后棄去上清液，而后血清培養(yǎng)液重新懸浮細胞，500×g離心10min。重復此操作清洗細胞2次；(6)檢查細胞懸液中細胞密度，并將其密度調(diào)整到5×105個細胞/mL；(7)以0.5mL/孔將細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，置入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)4～5h后細胞可以貼壁生長，24h細胞即可生成單層，單層細胞排列緊密，呈長、圓或多角形生長(圖1)。

免疫組化純度鑒定　^[2]

(1)將子宮上皮細胞接種于多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(2)待細胞單層形成以后取出蓋玻片，用預冷的PBS漂洗2次；(3)在含有4%多聚甲醛的PBS液中室溫下固定30min；(4)用含3%H2O2的PBS在室溫下封閉30min；(5)取出蓋玻片在PBS中洗3次，每次5min，擦去邊緣多余水分；(6)添加10%的正常羊血清，室溫下在濕盒內(nèi)放置40min；(7)輕輕甩掉血清，添加一抗工作液，置于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜；(8)次日將蓋玻片在PBS中漂洗3次，每次5min，擦干邊緣水分；(9)加稀釋好的生物素標記的羊抗兔IgG(GAR-B，1∶150)，放于濕盒內(nèi)室溫孵育2h；(10)將蓋玻片在PBS中漂洗3次，每次5min，擦干邊緣水分；(11)加稀釋好的辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)標記的鏈酶親和素(SP-HRP，1∶200)，放于濕盒室溫孵育2h；(12)將蓋玻片在PBS中漂洗3次，每次5min，擦干邊緣水分；(13)加入3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(3，3′-diaminobenzidin，DAB)顯色液，顯微鏡下控制顯色的強度；(14)蘇木精染液進行復染，10s后，于自來水中漂洗5min；(15)用30%、50%70%、95%、100%的梯度酒精脫水(組織塊脫水時間：30%、50%、70%各2min，100%5min)，二甲苯透明后中性樹膠封片。

角蛋白陽性反應(yīng)主要存在于細胞質(zhì)，染色為棕色，主要分布在胞質(zhì)區(qū)域，細胞核在蘇木精復染后呈藍色(圖2)。細胞純度大于95%。

相關(guān)研究^[3]

有研究在體外培養(yǎng)條件下研究卵巢激素誘導小鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞cyclinG1的表達及細胞增殖和細胞周期進程的變化，以探討孕激素依賴的細胞周期調(diào)控因子cyclinG1對子宮內(nèi)膜上皮細胞增殖的負調(diào)控作用。原代培養(yǎng)小鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞，待其生長匯合后分為4組：對照組(C組)、雌激素組(E組)、孕激素組(P組)、雌、孕激素共同作用組(EP組)。加入相應(yīng)激素作用24h后，用細胞免疫化學方法檢測各組細胞cyclinG1的表達水平；四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測各組細胞活力，間接觀察子宮內(nèi)膜上皮細胞的增殖情況；用流式細胞儀檢測分布在細胞周期各時相的子宮內(nèi)膜上皮細胞所占百分數(shù)。細胞免疫化學結(jié)果顯示，cyclinG1在C組和E組子宮內(nèi)膜上皮細胞上無明顯表達，而在P組和EP組子宮內(nèi)膜上皮細胞中表達明顯，且定位于細胞核內(nèi)。MTT法結(jié)果顯示，與C組相比，E組細胞活力明顯增高，而P組和EP組的細胞活力均明顯下降，表明雌激素能促進子宮內(nèi)膜上皮細胞增殖，而孕激素則具有抑制子宮內(nèi)膜上皮細胞增殖的作用。流式細胞術(shù)檢測顯示，與C組相比，E組中處于S期的子宮內(nèi)膜上皮細胞百分數(shù)增多；P組與EP組中處于S期的子宮內(nèi)膜上皮細胞百分數(shù)明顯減少，而處于G1期的細胞百分數(shù)和G2/M期的細胞百分數(shù)則明顯增加。上述結(jié)果提示，孕激素依賴的cyclinG1可能通過阻滯細胞周期進程來參與孕激素對子宮內(nèi)膜上皮細胞增殖的負調(diào)控作用。

主要參考資料

[1] 兒科學辭典

[2] 小鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞的分離和原代培養(yǎng)＊

[3] 孕激素誘導cyclinG1在小鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞的表達及其對細胞增殖的影響