背景及概述^[1]

卵巢顆粒細胞是動物生殖過程中非常重要的一類細胞。在動物體內(nèi)，顆粒細胞的增殖分泌功能與卵母細胞的生長和成熟緊密相關，二者可形成功能上的整體。在體外條件下進行顆粒細胞增殖與分化的研究，可為婦女及雌性動物卵巢功能的檢測、卵巢疾病引起的不孕癥的治療、避孕研究以及動物生殖毒理研究提供新的手段。到目前為止，對小鼠卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)的研究很少。有試驗對小鼠卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)的生物學特性以及增殖調(diào)控因素進行了初步研究，以期為進一步闡明卵巢顆粒細胞在體內(nèi)的作用及增殖、分化調(diào)節(jié)機制奠定基礎。

體外培養(yǎng)^[1]

每只小鼠腹腔注射PMSG(8～10U)48h后，頸椎脫臼處死，無菌條件下迅速取出雙側(cè)卵巢，用PBS(-)清洗3次，在體視顯微鏡下去除其周圍脂肪和被膜，用1mL注射器針頭刺破卵泡使顆粒細胞和卵母細胞釋放出來，加入1g/L透明質(zhì)酸酶消化使顆粒細胞與卵母細胞分離，用孔徑為0.074mm篩網(wǎng)過濾，1000r/min離心5min。棄上清，用PBS(-)清洗3次，加入基礎培養(yǎng)液(D/F12培養(yǎng)基+100U/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素+0.5μg/mL兩性霉素2B+體積分數(shù)10%FBS)重懸。

倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果表明，剛接種時顆粒細胞呈球形，10h后貼壁生長，培養(yǎng)24h后，形態(tài)不規(guī)則，呈多角形或梭形(圖12A)。培養(yǎng)5d時可鋪滿皿底，形成單層的顆粒細胞(圖12B)。部分顆粒細胞還出現(xiàn)聚集生長的特征，形成胚胎干細胞樣集落(圖12C)。

FSH、EGF和胰島素對小鼠卵巢顆粒細胞的影響^[1]

用臺盼藍染色檢測細胞存活率達70%以上時，調(diào)整細胞數(shù)，按照1×105mL-1接種，分別添加2μg/mL胰島素、50ng/mLFSH、20ng/mLEGF，于37℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。每間隔24h用胰蛋白酶對每組顆粒細胞進行消化計數(shù)。試驗重復3次，數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均數(shù)±標準差”表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。在細胞培養(yǎng)的第4天，與對照組相比，添加EGF或FSH對顆粒細胞具有顯著的促增殖的作用(P<0.05)，而胰島素促顆粒細胞增殖的作用不顯著(P>0.05)。

干細胞特性^[1]

研究發(fā)現(xiàn)，部分小鼠卵巢顆粒細胞具有聚集生長特性，能形成胚胎干細胞樣集落，這與體外培養(yǎng)的牛卵泡顆粒細胞的生長特性相似。為了進一步驗證顆粒細胞集落是否具有干細胞表面特異性標記，選擇了AKP染色和C2kit免疫組化染色對細胞進行了鑒定，結(jié)果顯示兩者均呈陽性，表明此類細胞可能具有干細胞特性。另外，卵巢顆粒細胞可用于核移植的現(xiàn)象本身也揭示顆粒細胞具有干細胞性質(zhì)。因為分化程度低的細胞作為核供體更有利于重構(gòu)胚的發(fā)育，利用哺乳動物體細胞作為核供體的成功率一般為0.4%～0.9%，而用小鼠卵巢顆粒細胞作為核供體時的成功率可達2.8%，不能排除這與部分顆粒細胞具有干細胞特性有關，但對于這方面的更深入鑒定尚待進一步研究證實。

相關研究^[2-4]

有實驗觀察右歸丸水提液對卵巢顆粒細胞分泌雌激素、孕酮功能的影響。方法是首先運用體外培養(yǎng)技術進行小鼠卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)，采用直接給藥法，觀察右歸丸水提液對小鼠卵巢顆粒細胞雌激素、孕酮的分泌量(放射免疫測定法)，并用檢測卵巢顆粒細胞內(nèi)cAMP水平(ELISA法)。結(jié)果顯示右歸丸水提液高劑量組(0.18g/ml)可明顯增加顆粒細胞雌激素、孕酮分泌量，同時顯著增加顆粒細胞內(nèi)cAMP的濃度。因此右歸丸溫補腎陽的作用可能與直接促進顆粒細胞的分泌功能有關，同時，其作用途徑可能是通過激活顆粒細胞內(nèi)酰苷酸環(huán)化酶而實現(xiàn)。

此外，為探討鎘對雌性生殖機能的影響，有研究在幼鼠皮下注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)，48h后腹腔注射不同劑量的氯化鎘，用瓊脂糖凝膠電泳及TUNEL法對小鼠卵巢顆粒細胞進行凋亡檢測；免疫組織化學法檢測顆粒細胞的bax表達。結(jié)果顯示注射氯化鎘后48h的高、中、低劑量組小鼠卵巢顆粒細胞(GC)凋亡率分別為(13.8871±1.3299)%、(10.7573±1.2293)%、10.0208±0.9837)%，均顯著高于對照組(0.6378±0.3872)%(P0.01)；96h對照組GC凋亡率顯著升高，高劑量組與其它組間差異明顯，中、低劑量組與對照組差異不明顯。凝膠電泳僅96h高劑量組呈現(xiàn)梯狀帶。48h、96h各劑量組bax表達明顯高于對照組(P0.01)?？梢婃k對卵巢顆粒細胞的凋亡有促進作用，并有一定的劑量相關性；TUNEL法檢測細胞凋亡優(yōu)于電泳法，當細胞凋亡率較低時(20%)，電泳檢測不到DNA梯狀帶；小鼠卵巢顆粒細胞凋亡和bax的表達有一定的相關性，隨凋亡率的升高bax表達呈上升趨勢。

另外，還有實驗研究鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）及其活性中間產(chǎn)物鄰苯二甲酸單（2-乙基）己酯（MEHP）對卵巢顆粒細胞及其激素合成、分泌功能的影響。方法是體外培養(yǎng)健康初斷乳ICR小鼠卵巢顆粒細胞，分別加入DEHP（10、50、250nmol/L），MEHP（10、50、250nmol/L）和溶劑對照（DMSO），作用細胞24h。用RT-PCR法測定原代小鼠顆粒細胞中類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）和P450側(cè)鏈裂解酶（P450scc）mRNA水平；用Realtime-PCR法測定原代小鼠顆粒細胞中芳香化酶（CYP19）和過氧化物酶體增殖劑激活受體（PPARα、PPARβ、PPARγ）mRNA水平；用酶聯(lián)免疫法（EIA）檢測卵巢顆粒細胞上清液中雌二醇和孕酮的水平。結(jié)果顯示與對照組比較，250nmol/LMEHP抑制StAR基因及P450scc基因表達（P均〈0.05）；250nmol/LDEHP對CYP19基因表達有促進作用（P〈0.05）；而10、50nmol/LDEHP及50、250nmol/LMEHP對CYP19基因表達均有抑制作用（P〈0.05）。除10nmol/LDEHP外，DEHP及MEHP其它濃度組均能抑制PPARα、PPARβ基因的表達（P〈0.05）；10nmol/LDEHP及MEHP對PPARγ基因表達有促進作用（P〈0.05），而250nmol/LMEHP對PPARγ基因表達有抑制作用（P〈0.05）。各劑量DEHP及MEHP均能使顆粒細胞分泌雌二醇增加（P〈0.05），10nmol/LDEHP、50及250nmol/LMEHP抑制顆粒細胞分泌孕酮（P〈0.05）。因此DEHP及MEHP影響小鼠卵巢顆粒細胞類固醇激素合成酶、PPARs的基因表達及分泌功能。

主要參考資料

[1]小鼠卵巢顆粒細胞的體外培養(yǎng)

[2] 右歸丸水提液對小鼠卵巢顆粒細胞雌激素、孕酮分泌的影響及機制

[3] 鎘對小鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響研究

[4] DEHP及MEHP對小鼠卵巢顆粒細胞分泌功能的影響