背景^[1-3]

WESTERN封閉液也稱為Western Blocking Buffer，是蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）實驗中用于封閉轉(zhuǎn)移了蛋白樣品的PVDF膜或NC膜的一種試劑。其主要目的是減小后續(xù)的一抗或二抗與膜的非特異性結(jié)合，從而降低背景著色，增強信噪比。

WESTERN封閉液的主要成分通常包括TBS、BSA（牛血清白蛋白）和防腐劑等。其中，BSA經(jīng)過優(yōu)化選擇，能有效封閉膜上的蛋白結(jié)合位點，同時減少后續(xù)抗體的非特異性結(jié)合。除了使用含有BSA的封閉液外，還有一些實驗會使用含脫脂奶粉、明膠或酪蛋白的封閉液，這些成分也具有一定的封閉效果。

WESTERN封閉液的使用通常是在轉(zhuǎn)膜和洗滌步驟之后進行。封閉的時間和溫度可以根據(jù)實驗的具體情況進行調(diào)整。對于一些背景較高的抗體，可以選擇在4℃條件下封閉過夜。此外，WESTERN封閉液應(yīng)妥善保存，避免室溫放置過久或反復(fù)凍融，以免導(dǎo)致蛋白降解和活性喪失。

WESTERN封閉液

Western封閉液是用于Western Blot實驗中的一個重要組分，它的主要作用是減少非特異性結(jié)合，提高抗體與抗原結(jié)合的特異性。

Western Blot是一種常用的蛋白質(zhì)分析方法，通過聚丙烯酰胺電泳將蛋白樣本按分子量大小分離后轉(zhuǎn)移到雜交膜上，然后利用一抗和二抗對靶蛋白進行特異性檢測。在這個過程中，封閉液的應(yīng)用是一個關(guān)鍵步驟，它能夠幫助防止抗體在膜上非特異性地結(jié)合，這種非特異性結(jié)合會導(dǎo)致背景信號增強，從而干擾實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。正確的封閉液選擇對于Western Blot實驗的成功至關(guān)重要。

此外，還有一些Western封閉液，它們被設(shè)計用于Western Blot中轉(zhuǎn)移了蛋白樣品的PVDF膜或NC膜的封閉。這些封閉液可以有效減小后續(xù)的一抗或二抗和膜的非特異性結(jié)合，從而提高實驗的靈敏度和特異性。

在選擇Western封閉液時，需要考慮實驗的具體需求，比如膜的類型、樣品的特性以及所需的實驗靈敏度等。使用封閉液時，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書或?qū)嶒炇业臉?biāo)準(zhǔn)操作流程進行，以確保實驗結(jié)果的可靠性。

應(yīng)用^[4][5]

WESTERN封閉液可以用于利鈉肽受體C在糖尿病性心肌病發(fā)病中的作用和分子機制研究

細(xì)胞提取和處理實驗中采用組織消化和差速貼壁法提取新生大鼠乳鼠心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞。心肌細(xì)胞(cardiomyocytes,CM)培養(yǎng)在含8%馬血清和5%新生牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中。心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts,CF)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞培養(yǎng)在含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中。分別給予正常糖(normalglucose,NG)組和高糖(highglucose,HG)組的細(xì)胞終濃度為5.5 mM和33.3 mM的葡萄糖刺激,并給予高滲(high osmotic,HO)組細(xì)胞終濃度為33.3 mM的甘露醇刺激。

細(xì)胞主要處理如下:(1)分別給予CF NG、HG和HO刺激并收集細(xì)胞;(2)分別給予CF對照小干擾RNA(si-NC)和NPRC小干擾RNA(si-NPRC)轉(zhuǎn)染,隨后給予NG和HG刺激,收集細(xì)胞;(3)分別給予CM si-NC和si-NPRC轉(zhuǎn)染,隨后給予NG和HG刺激,然后用不同處理的CM上清處理CF,收集細(xì)胞;(4)分別給予CF si-NC、si-NPRC、si-NPRC+si-TGIF1轉(zhuǎn)染,隨后給予HG刺激,收集細(xì)胞;(5)分別給予CF對照腺病毒(Ad-GFP)、ANP過表達腺病毒(Ad-ANP)、BNP過表達腺病毒(Ad-BNP)和CNP過表達腺病毒(Ad-CNP)轉(zhuǎn)染并收集細(xì)胞;(6)給予CF cAMP/PKA的激活劑forskolin和抑制劑H89處理并收集細(xì)胞;(7)給予CF cGMP/PKG的激活劑8-br-cGMP和抑制劑KT5823處理并收集細(xì)胞;7.細(xì)胞免疫熒光檢測對不同處理的細(xì)胞爬片行4%多聚甲醛固定、0.1%Triton X-100通透、5%BSA封閉和一抗過夜孵育,次日清洗后孵育二抗,并滴加DAPI染核,應(yīng)用熒光顯微鏡檢測熒光信號并保存。

細(xì)胞增殖檢測實驗對細(xì)胞進行處理后,向細(xì)胞培養(yǎng)基中以1:2500的比例滴加EdU溶液,孵育12小時后,對細(xì)胞進行固定、通透、染色處理,檢測熒光信號并保存。另外,向處理后的細(xì)胞培養(yǎng)基中以1:10的比例加入CCK-8溶液,孵育4小時后,于酶標(biāo)儀上讀取450nm處的吸光度(OD值)。免疫共沉淀(CO-IP)實驗對細(xì)胞進行處理后,用裂解液裂解細(xì)胞,分別加入cPML的抗體和對照小鼠IgG孵育1小時,然后加入瓊脂糖珠孵育過夜。次日用裂解液清洗瓊脂糖珠,隨后進行蛋白免疫印跡實驗(Western blot)利用裂解液提取細(xì)胞蛋白,BCA法測定蛋白濃度后,進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,之后應(yīng)用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印到膜上。膜經(jīng)WESTERN封閉液封閉封閉后過夜孵育一抗,次日清洗后孵育二抗,應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白信號。

細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白分離提取對細(xì)胞進行處理后,利用胞漿和胞核提取緩沖液分別提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白并行Western blot檢測。細(xì)胞cAMP和cGMP水平檢測細(xì)胞經(jīng)處理后,應(yīng)用Cyclic AMP/GMP化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測細(xì)胞cAMP和cGMP水平,并在酶標(biāo)儀上讀取450 nm的OD值。細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序細(xì)胞經(jīng)處理后,用Trizol溶液反復(fù)吹打裂解細(xì)胞,將裂解液凍存于-80℃后,送往上海鯨舟基因科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序及分析。RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR(RT-PCR)提取細(xì)胞總RNA,測量濃度后進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,然后通過實時熒光PCR獲取細(xì)胞中NPRA、NPRB、NPRC、TGIF1基因的Ct值,以2-ΔΔCt公式計算基因的相對表達量。蛋白免疫印跡實驗(Western blot)利用蛋白提取試劑盒提取小鼠心臟組織蛋白,或利用裂解液提取細(xì)胞蛋白,BCA法測定蛋白濃度后,進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,之后應(yīng)用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印到膜上。膜經(jīng)WESTERN封閉液封閉后過夜孵育一抗,次日清洗后孵育二抗,應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白信號。

參考文獻

[1]IDF diabetes Atlas:Global,regional and country-level diabetes prevalence estimates for 2021 and projections for 2045.[J].Sun Hong;Saeedi Pouya;Karuranga Suvi;Pinkepank Moritz;Ogurtsova Katherine;Duncan Bruce B;Stein Caroline;Basit Abdul;Chan Juliana C N;Mbanya Jean Claude;Pavkov Meda E;Ramachandaran Ambady;Wild Sarah H;James Steven;Herman William H;Zhang Ping;Bommer Christian;Kuo Shihchen;Boyko Edward J;Magliano Dianna J.Diabetes research and clinical practice,2021

[2]Heart failure in diabetes.[J].Jankauskas Stanislovas S;Kansakar Urna;Varzideh Fahimeh;Wilson Scott;Mone Pasquale;Lombardi Angela;Gambardella Jessica;Santulli Gaetano.Metabolism:clinical and experimental,2021

[3]2021 ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure.[J].McDonagh Theresa A;Metra Marco;Adamo Marianna;Gardner Roy S;Baumbach Andreas;B?hm Michael;Burri Haran;Butler Javed;?elutkien?Jelena;Chioncel Ovidiu;Cleland John G F;Coats Andrew J S;CrespoLeiro Maria G;Farmakis Dimitrios;Gilard Martine;Heymans Stephane;Hoes Arno W;Jaarsma Tiny;Jankowska Ewa A;Lainscak Mitja;Lam Carolyn S P;Lyon Alexander R;McMurray John J V;Mebazaa Alex;Mindham Richard;Muneretto Claudio;Francesco Piepoli Massimo;Price Susanna;Rosano Giuseppe M C;Ruschitzka Frank;Kathrine Skibelund Anne.European heart journal,2021

[4]PSPC1 is a new contextual determinant of aberrant subcellular translocation of oncogenes in tumor progression.[J].Lang YawDong;Jou YuhShan.Journal of biomedical science,2021

[5]孟霖霖.利鈉肽受體C在糖尿病性心肌病發(fā)病中的作用和分子機制研究[D].山東大學(xué),2024.