背景^[1-7]

Recombinant Protein A/G/L（重組蛋白a/g/l）是微生物來(lái)源的天然或重組蛋白質(zhì)，可以和哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白結(jié)合。將這些蛋白偶聯(lián)于支持物上，利用親和層析來(lái)純化抗體，也可用于免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)或免疫共沉淀(Co-IP)。不同的抗體結(jié)合蛋白與不同的免疫球蛋白的結(jié)合能力并不一樣，它們受到后者的來(lái)源及亞類的影響。

因此對(duì)于不同的抗體需要選擇不同的抗體結(jié)合蛋白。將SPA、SPG和PPL的單結(jié)構(gòu)域基因優(yōu)化、人工合成，使其在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)可溶性融合串聯(lián)表達(dá)，將優(yōu)選出的重組蛋白純化、標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物經(jīng)Western blot、ELISA檢測(cè)，可與多物哺乳動(dòng)物免疫球蛋白結(jié)合，可作為哺乳動(dòng)物血清學(xué)檢測(cè)中的通用抗體，替代抗免疫球蛋白抗體運(yùn)用到哺乳動(dòng)物抗體檢測(cè)方法中，并建立一種多物種通用口蹄疫檢測(cè)方法。不但實(shí)現(xiàn)對(duì)牛、豬、羊、鹿口蹄疫感染進(jìn)行通用檢測(cè)，還為多種動(dòng)物共患傳染病的監(jiān)測(cè)和防控提供方便、可靠的技術(shù)支持。

金黃色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal proteinA,SPA）、鏈球菌（C和G群）蛋白G（Streptococcal protein G,SPG）和大消化鏈球菌蛋白L（Peptostreptococcus protein L,PPL）是典型的免疫球蛋白結(jié)合蛋白。它們能結(jié)合大多數(shù)哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白，但結(jié)合方式和結(jié)合譜不同。三種蛋白可以優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，不僅有更好的結(jié)合能力，還具有更廣的結(jié)合譜，有很好的應(yīng)用前景。蛋白A、蛋白G、蛋白L都是免疫球蛋白結(jié)合分子，這類分子對(duì)哺乳動(dòng)物Ig上的特殊位點(diǎn)表現(xiàn)出很強(qiáng)的親和性。

盡管這些分子的精確功能還沒(méi)有完全為人們所知，但它在細(xì)菌的致病性方面扮演著重要的角色。常見(jiàn)的細(xì)菌病原體金黃色葡萄球菌產(chǎn)生一個(gè)42KDa的毒力因子蛋白A（SPA），包含五個(gè)高度同源性的胞外Ig結(jié)合區(qū)域即E、D、A、B和C。鏈球菌蛋白G(SPG)包含兩個(gè)到三個(gè)結(jié)合哺乳動(dòng)物Ig恒定區(qū)Fc部位的結(jié)構(gòu)域。與蛋白A和蛋白G不同，蛋白L(PPL)只結(jié)合哺乳動(dòng)物κ型Ig輕鏈。

三種蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上有相似和不同之處，每種蛋白都不能單獨(dú)和所有哺乳動(dòng)物Ig結(jié)合。蛋白A，蛋白G，蛋白L的單個(gè)結(jié)構(gòu)域已被證實(shí)有結(jié)合Ig的功能。Protein A/G/L Ig結(jié)合蛋白（SPA、SPG、PPL）可結(jié)合多種哺乳動(dòng)物的Ig，據(jù)此原理已開發(fā)出商品化的可檢測(cè)多物種的布魯氏菌病ELISA?？谔阋呖筛腥径喾N有蹄類哺乳動(dòng)物，并且現(xiàn)在也需要一種能夠同時(shí)檢測(cè)多種動(dòng)物口蹄疫感染的通用ELISA方法。

應(yīng)用^[8]

Recombinant Protein A/G/L用于口蹄疫鑒別診斷：

選取PPL B3結(jié)構(gòu)域進(jìn)行基因優(yōu)化,與現(xiàn)有的AG串聯(lián)基因形成不同拷貝數(shù)的AGL基因,連接到p ET-30a(+)原核表達(dá)載體中,構(gòu)建pET-30a(+)-L、pET-30a(+)-AGL、p ET-30a(+)-[AGL]2、p ET-30a(+)-[AGL]3四種重組表達(dá)載體。經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)得到4種重組蛋白即L、AGL、[AGL]2、[AGL]3,均為可溶性表達(dá)。經(jīng)Ni-NTA親和層析純化得到的四種蛋白L、AGL、[AGL]2、[AGL]3,其中[AGL]2重組蛋白表達(dá)量高而且純化回收率高。

Western blot分析鑒定AGL、[AGL]2、[AGL]3蛋白均能與牛血清發(fā)生特異性反應(yīng)。Westernblot和間接ELISA分析結(jié)果顯示[AGL]2重組蛋白與可與9種哺乳動(dòng)物Ig反應(yīng),而且結(jié)合能力強(qiáng)于[AG]3重組蛋白。對(duì)[AGL]2重組蛋白進(jìn)行HRP標(biāo)記(過(guò)碘酸鈉法),經(jīng)直接ELISA方法測(cè)定[AGL]2-HRP有很高的結(jié)合兔IgG活性。Dot-ELISA和間接ELISA結(jié)果顯示[AGL]2酶標(biāo)蛋白可結(jié)合9種哺乳動(dòng)物Ig,而且[AGL]2酶標(biāo)蛋白結(jié)合人Ig M和人Ig A能力強(qiáng)于[AG]4酶標(biāo)蛋白。經(jīng)驗(yàn)證,[AGL]2酶標(biāo)蛋白可檢測(cè)兔源免疫抗體;特異性檢測(cè)牛、犬、鹿、豬、羊血清中的布魯氏菌病抗體;特異性檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)抗體

參考文獻(xiàn)

[1]Protein A affinity precipitation of human immunoglobulin G[J].Lars Janoschek,Matthias Freiherr von Roman,Sonja Berensmeier.Journal of Chromatography B.2014

[2]A bacterial engineered glycoprotein as a novel antigen for diagnosis of bovine brucellosis[J].Andrés E.Ciocchini,Diego A.Rey Serantes,Luciano J.Melli,Leticia S.Guidolin,Jeremy A.Iwashkiw,Sebastián Elena,Cristina Franco,Ana M.Nicola,Mario F.Feldman,Diego J.Comerci,Juan E.Ugalde.Veterinary Microbiology.2014

[3]Validation of a second generation competitive enzyme immunoassay(CELISA)for the diagnosis of brucellosis in various species of domestic animals[J].K.Nielsen,P.Smith,W.L.Yu,C.Elmgren,G.Halbert,P.Nicoletti,B.Perez,S.Conde,L.Samartino,A.Nicola,R.Bermudez,T.Renteria.Veterinary Immunology and Immunopathology.2008(3)

[4]All individual domains of staphylococcal protein A show Fab binding[J].Birger Jansson,Mathias Uhlén,Per‐ke Nygren.FEMS Immunology&Medical Microbiology.2006(1)

[5]Kinetic Studies of Folding of the B-domain of Staphylococcal Protein A with Molecular Dynamics and a United-residue(UNRES)Model of Polypeptide Chains[J].Mey Khalili,Adam Liwo,Harold A.Scheraga.Journal of Molecular Biology.2005(3)

[6]Quantitative Risk Assessment of FMD Virus Transmission via Water[J].Jack Schijven,Gerard B.J.Rijs,Ana Maria De Roda Husman.An International Journal.2005(1)

[7]Differential binding characteristics of protein G and protein A for Fc fragments of papain-digested mouse IgG[J].Cemalettin Aybay.Immunology Letters.2002(3)

[8]彭統(tǒng)全.串聯(lián)表達(dá)蛋白A/G/L Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域及其在口蹄疫鑒別診斷中的應(yīng)用[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.