背景^[1-3]

TCMK-1小鼠腎小管上皮細胞系是一種來源于小鼠腎小管上皮細胞的細胞系，常用于研究腎臟疾病的發(fā)生機制、藥物篩選和毒性評價等。該細胞系具有以下特點：

來源：TCMK-1細胞系來源于小鼠腎小管上皮細胞，經過多次傳代和篩選，形成了一個相對穩(wěn)定的細胞系。

形態(tài)特征：TCMK-1細胞呈多邊形或長條形，大小約為15-30微米，胞質豐富，核大而圓，核仁明顯。

生長特性：TCMK-1細胞生長迅速，傳代周期約為24-48小時，可在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長。

特異性標志物：TCMK-1細胞表達多種特異性標志物，如Ksp-cadherin、AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、NHE3、Na-K-ATPase等，可用于鑒定其腎小管上皮細胞特性。

其他特性：TCMK-1細胞還具有一定的增殖能力，可用作研究腎臟疾病發(fā)生機制和藥物篩選的模型。

TCMK-1小鼠腎小管上皮細胞系

TCMK-1小鼠腎小管上皮細胞系培養(yǎng)操作

1)復蘇TCMK-1小鼠腎小管上皮細胞系：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產品說明書為主。

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2)TCMK-1小鼠腎小管上皮細胞系傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)TCMK-1小鼠腎小管上皮細胞系凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。

b、根據細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應用^[4][5]

TCMK-1小鼠腎小管上皮細胞系可以用于Tisp40在腎間質纖維化中的作用和機制研究

Tisp40與腎間質纖維化的關系目的:探討Tisp40在缺血再灌注(Ischemia-reperfusion,I/R)誘導的腎間質纖維化及轉化生長因子betal(Transforming growth factor betal,TGF-β1)誘導的TCMK-1小鼠腎小管上皮細胞系中表達量的變化,驗證所構建的慢病毒轉染Tisp40過表達細胞系TCMK-1/Tisp40效果并在3種所構建的siRNA-Tisp40中篩選沉默效果最好的siRNA-Tisp40。

方法:體內實驗C57BL/6小鼠I/R建立腎臟纖維化動物模型,免疫組化、RT-PCR及Western blot檢測各組小鼠腎臟Tisp40的分布與表達。體外實驗采用TGF-β1(10ng/ml)刺激TCMK-1小鼠腎小管上皮細胞系24h建立腎細胞纖維化模型,Western blot檢測TGF-β1不同濃度(0.1,1,10ng/ml)及刺激時間(4,8,12,24,48h)下Tisp40蛋白的表達變化。在野生型TCMK-1小鼠腎小管上皮細胞系(TCMK-1/wildtype,TCMK-1/wt)及Tisp40過表達的TCMK-1/Tisp40細胞中,RT-PCR及Western blot檢測Tisp40 mRNA及蛋白表達變化,免疫熒光評估所構建的TCMK-1/Tisp40細胞效果。Western blot檢測Tisp40被沉默后的蛋白表達,比較三種siRNA-Tisp40(siRNAl-Tisp40,siRNA2-Tisp40,siRNA3-Tisp40)沉默效率。

結果:體內實驗假手術組小鼠(Sham)腎臟Tisp40表達較少;缺血再灌注纖維化組(I/R)中小鼠腎臟Tisp40mRNA及蛋白表達明顯增加(p<0.05),Tisp40蛋白主要表達于腎小管。體外實驗Tisp40隨TGF-β1濃度(0.1,1,10ng/ml)及刺激時間(4,8,12,24,48h)改變,表達逐漸增多,存在濃度及時間依賴性,在lOng/mlTGF-βi刺激24h后Tisp40表達基本穩(wěn)定;TCMK-1小鼠腎小管上皮細胞系/wt細胞在TGF-β1刺激前,僅少量表達Tisp40,TCMK-1/wt細胞及TCMK-1/Tisp40細胞經TGF-β1刺激24h后,Tisp40mRNA及蛋白表達明顯增多(p<0.05),在TGF-β1刺激前后,TCMK-1小鼠腎小管上皮細胞系/Tisp40細胞的Tisp40表達均高于TCMK-1/wt細胞(p<0.05),Tisp40過表達細胞系TCMK-1/Tisp40構建成功。3種siRNA-Tisp40均可沉默Tisp40,siRNA3-Tisp40沉默效率最高。

參考文獻

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