背景^[1-3]

大鼠椎間盤髓核細(xì)胞是從大鼠的椎間盤組織中分離出來的一種細(xì)胞，屬于原代細(xì)胞。這種細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中可以貼壁或懸浮生長，通常用于研究脊柱退行性疾病、藥物篩選、基因治療等方面。

大鼠椎間盤髓核細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法通常包括組織塊法、酶消化法等。其中，組織塊法是將椎間盤組織切成小塊，然后種植在培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞從組織塊中生長出來。酶消化法則是使用酶將椎間盤組織分解成單個(gè)細(xì)胞，然后進(jìn)行培養(yǎng)。

大鼠椎間盤髓核細(xì)胞在培養(yǎng)過程中需要使用特定的培養(yǎng)基和生長因子，以保證細(xì)胞的生長和繁殖。同時(shí)，還需要注意細(xì)胞的交叉污染和支原體感染等問題。

大鼠椎間盤髓核細(xì)胞

大鼠椎間盤髓核細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇大鼠椎間盤髓核細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)大鼠椎間盤髓核細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)大鼠椎間盤髓核細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

大鼠椎間盤髓核細(xì)胞可以用于線粒體凋亡通路在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠髓核細(xì)胞凋亡中的作用研究

體外構(gòu)建大鼠椎間盤髓核細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,探討線粒體凋亡通路在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)椎間盤髓核細(xì)胞凋亡中的作用及意義,為進(jìn)一步預(yù)防和治療椎間盤退變性疾病奠定實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。研究方法：1、實(shí)驗(yàn)用SPF級(jí)雄性SD大鼠由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,無菌條件下取出大鼠腰椎節(jié)段,解剖顯微鏡下尖刀切開椎間盤纖維環(huán),用眼科鑷夾取膠凍樣髓核組織。采用胰酶/膠原酶消化法原代培養(yǎng)大鼠椎間盤髓核細(xì)胞,運(yùn)用免疫組化染色,免疫熒光檢測(cè)對(duì)椎間盤髓核細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

2、以不同濃度過氧化氫(H202)作用于椎間盤髓核細(xì)胞制造氧化應(yīng)激模型；將生長良好的第3代椎間盤髓核細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,按5000個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后,融合達(dá)80%-90%時(shí),換無血清DMEM-F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h,使細(xì)胞處于靜止期。對(duì)照組不給予H2O2處理,實(shí)驗(yàn)組用50,100,200,400μmol/LH202處理6h。CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率。

3、細(xì)胞凋亡率檢測(cè)：對(duì)照組不給予H202處理,實(shí)驗(yàn)組取兩個(gè)濃度組(100μmol/L,200μmol/L H202處理6h。Hoechst33258染色以及Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

4、DCFH-DA熒光探針檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量、JC-1染色檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體膜電位的變化。

5、免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白(細(xì)胞色素C,Bax,Bcl-2,caspase-3)的變化。

6、所有統(tǒng)計(jì)分析均通過SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。數(shù)據(jù)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用最小顯著差異法(least significant difference,LSD)方法檢驗(yàn),P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

研究結(jié)果：1、原代培育的細(xì)胞呈類呈多角形、紡錘形或梭形,達(dá)亞融合狀態(tài)后呈漩渦狀或火焰狀的細(xì)胞團(tuán),胞質(zhì)豐富,具有折光性,有一個(gè)較大的卵圓形核,輪廓清晰。Ⅱ型膠原免疫組化、免疫熒光染色均可見陽性表達(dá),因此可鑒定此細(xì)胞為椎間盤髓核細(xì)胞。

2、CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示H2O2對(duì)椎間盤髓核細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用,隨著濃度的升高,細(xì)胞生存率降低,呈濃度依賴關(guān)系,各濃度組細(xì)胞生存率與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,隨著H202濃度升高細(xì)胞凋亡比例增加,100μmol/L H2O2細(xì)胞凋亡率為(22.43±2.66)%,200μmol/L H2O2細(xì)胞凋亡率為(32.5±2.22)%,均較對(duì)照組明(5.3±1.87)%明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3、與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠椎間盤髓核細(xì)胞受H202誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增加,線粒體跨膜電位下降,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)4、Western blot檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)H202誘導(dǎo)后Bcl-2蛋白表達(dá)降低,而胞漿細(xì)胞色素C、Bax、活化型caspase-3升高,與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

參考文獻(xiàn)

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