背景^[1-3]

小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞是睪丸中的一種支持細(xì)胞，位于生精小管之間。它們的主要功能是提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和支持生殖細(xì)胞的發(fā)育和成熟。

小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞在小鼠睪丸中占據(jù)了大約40%的體積，并通過(guò)其長(zhǎng)長(zhǎng)的突起與生精小管相連。它們通過(guò)分泌多種生長(zhǎng)因子、激素和其他物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)生精小管內(nèi)生殖細(xì)胞的發(fā)育和成熟。

小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞還具有多種其他功能，包括：

維持生精小管的結(jié)構(gòu)：Sertoli細(xì)胞通過(guò)分泌膠原蛋白和其他基質(zhì)分子來(lái)維持生精小管的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。

支持精子的發(fā)育和成熟：Sertoli細(xì)胞通過(guò)分泌多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素來(lái)支持精子的發(fā)育和成熟。

保護(hù)生殖細(xì)胞：Sertoli細(xì)胞可以分泌一些抗炎和抗氧化物質(zhì)來(lái)保護(hù)生殖細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和其他有害因素的損傷。

小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞

小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞可以用于線粒體分裂及自噬在鎘致小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制

以鎘為受試物,選擇雄性小鼠、原代小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞系TM3細(xì)胞作為研究對(duì)象,探討鎘是否通過(guò)調(diào)控線粒體的融合與分裂以及線粒體自噬等途徑誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡,為全面了解鎘的男性生殖毒性機(jī)制提供新的證據(jù)。

鎘誘導(dǎo)雄性小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡與自噬抑制的研究目的:在動(dòng)物水平探討氯化鎘(Cadmium chloride,CdCl2)處理對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞毒性的潛在機(jī)制。

方法:根據(jù)隨機(jī)數(shù)值表將20只4周齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分成四組,每組5只,分別以0、0.5、1.0和2.0 mg/kg/day濃度的CdCl2連續(xù)28天暴露,構(gòu)建染鎘動(dòng)物模型。通過(guò)HE染色、精子計(jì)數(shù)和精子畸形率檢測(cè)評(píng)估鎘暴露后睪丸毒性。采用ELISA法、免疫組織化學(xué)法分別測(cè)定鎘暴露后血清睪酮含量以及小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。采用免疫熒光結(jié)合TUNEL染色分析小鼠睪丸中睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡情況。使用透射電子顯微鏡和免疫熒光分別觀察小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)自噬體和LC3的變化。

結(jié)果:鎘暴露后,2.0 mg/kg鎘處理組小鼠體重從第二周開(kāi)始下降(P<0.05),而0.5和1.0mg/kg鎘處理組中小鼠體重則從第三周開(kāi)始下降(P<0.05),在4周暴露結(jié)束時(shí),所有鎘處理組小鼠體重均較對(duì)照組下降。但睪丸/體重比值無(wú)顯著變化,精子數(shù)量降低且精子畸形率升高(P<0.05)。與對(duì)照組相比,鎘處理組小鼠的血清睪酮含量降低,生精小管結(jié)構(gòu)異常,精子細(xì)胞排列紊亂;睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少且細(xì)胞凋亡率隨著染鎘劑量的升高而增加(P<0.05)。透射顯微鏡顯示,與對(duì)照組相比,鎘處理組小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有較多的自噬泡、自噬體并伴隨著極少量的自噬溶酶體形成。對(duì)睪丸組織的免疫熒光檢測(cè)顯示,鎘處理組自噬關(guān)鍵蛋白LC3在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),且隨著染鎘劑量的升高而表達(dá)增加。

結(jié)論:鎘暴露破壞了小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu),導(dǎo)致精子數(shù)量減少、精子畸形率增加、睪酮含量降低,產(chǎn)生生殖毒性。同時(shí),鎘暴露誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡以及調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的自噬水平。鎘誘導(dǎo)線粒體過(guò)度分裂致小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的機(jī)制目的:第一部分的研究結(jié)果表明,在動(dòng)物水平鎘誘導(dǎo)了小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡。以TM3細(xì)胞(小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的模式細(xì)胞系)為研究對(duì)象,通過(guò)觀察線粒體形態(tài)變化、線粒體分裂和融合蛋白表達(dá)、線粒體功能以及線粒體依賴性凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)等指標(biāo),探討鎘暴露對(duì)TM3細(xì)胞凋亡的影響及可能的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

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