背景[1-6]
RNA pulldown試劑盒是利用T4 RNA連接酶將單個脫硫生物素化的胞苷二磷酸連接到單鏈RNA的3’端。3’端的末端標記不干擾RNA結構，因此，該生物素標記不會影響RNA與蛋白的互相作用。每一次反應需要50pmol RNA。孵育時間的延長，以及在標記反應中加入DMSO，可優(yōu)化RNA的標記效率。RRNA結合蛋白(RBPs)在轉錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達起著重要的作用，具體的作用包括mRNA前體的剪接、多腺苷化和穩(wěn)定性的維持，mRNA從細胞核向細胞質(zhì)的運輸，mRNA的定位和翻譯等。
RBPs在這些過程中的調(diào)節(jié)作用是通過結合新合成的或者成熟后的轉錄物的特定序列實現(xiàn)的。于此同時，有很多RBPs能夠識別RNA中的特定核苷酸序列。為了研究RNA與蛋白的相互作用建立了很多方法，這些方法包括EMSA、SELEX技術、RNA footprinting、RNA免疫沉淀(RIP)和RNA pulldown技術。RNA pulldown技術利用脫末端標記的RNA高效富集及鑒定RNA結合蛋白(RBPs)。
此方法避免了抗體的使用，大大延伸了使用范圍。隨著RNA pulldown技術的不斷完善，其在生命科學研究及醫(yī)學領域中扮演的角色愈加重要。NA pull-down實驗就是先將RNA進行標記（如生物素探針標記），再與細胞裂解液共同孵育，從而形成RNA-蛋白質(zhì)復合物，之后再分離復合物得到蛋白質(zhì)，通過western blot 或mass Spectrometry檢測蛋白質(zhì)的技術。
目前RNA pull-down技術已成為研究miRNA、lncRNA與相互作用蛋白的主要技術手段之一。現(xiàn)如今的研究中，RNA pulldown研究的探針主要是合成生物素標記的單鏈探針，拓展了RNA的研究范圍。Tsai等通過改進的RNA pulldown技術分析了長鏈非編碼RNA(lincRNA)調(diào)節(jié)染色體狀態(tài)和表觀遺傳。他們發(fā)現(xiàn)lincRNA HOTAIR作為至少兩個組蛋白修飾復合體的腳手架。HOTAIR的5’端結合多梳抑制復合體2(PRC2)，3’端結合LSD1/CoREST/REST復合體，完成RNA介導的RPC2和LSD1復合體的組裝從而完成H3K27和H3K4兩個位點的甲基化。
RNA pulldown試劑盒使用體外轉錄法標記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復合物。該復合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結合，從而與孵育液中的其他成分分離。復合物洗脫后，通過western blot實驗檢測特定的RNA結合蛋白是否與RNA相互作用。蛋白質(zhì)與RNA的相互作用是許多細胞功能的核心，如蛋白質(zhì)合成、mRNA組裝、病毒復制、細胞發(fā)育調(diào)控等。若待檢測目的蛋白明確，選擇Western blot鑒定；若不明確，則可選擇質(zhì)譜鑒定。
缺點：(1)實驗中使用到的珠子(瓊脂糖珠子或磁珠)與蛋白的非特異結合，容易造成實驗結果的假陽性；(2)RNA探針與蛋白結合的特異性不高；(3)實驗過程還會受到核酸酶污染的影響。
應用[7]
RNA pulldown試劑盒可用于LncRNA-miRNA-mRNA相互作用的研究：
非編碼RNA依照其長度的不同可分為短鏈非編碼RNA、中等長度非編碼RNA以及長鏈非編碼RNA(Long no-coding RNA,LncRNA)。短鏈非編碼RNA長度小于50 nt,中等長度非編碼RNA長度介于50-200 nt,而長非編碼RNA長度大于200 nt。而且近年來研究表明,不同長度的RNA之間存在相互作用,特別是LncRNA與miRNA、miRNA與mRNA、lncRNA與mRNA都存在相互調(diào)節(jié)的關系,形成了lncRNA-miRNA-mRNA的相互調(diào)控網(wǎng)絡,理清這一復雜而精細的調(diào)控網(wǎng)絡,對于揭示RNA分子間的相互作用及闡釋其功能至關重要。
參考文獻
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