背景^[1-3]

小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞是研究淋巴系統(tǒng)和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要工具之一。這些細(xì)胞可以在體外進(jìn)行培養(yǎng)，并且有一些特定的特征和生長(zhǎng)條件。

小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)可能包括鋪路石狀細(xì)胞和不規(guī)則細(xì)胞。這些細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中會(huì)貼壁生長(zhǎng)，并需要特定的培養(yǎng)條件，例如氣相和溫度等。一般來說，這些細(xì)胞會(huì)在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)，并且需要定期進(jìn)行傳代和凍存。

在進(jìn)行小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)，需要注意一些細(xì)節(jié)。例如，這些細(xì)胞需要使用完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并且需要添加一定濃度的DMSO進(jìn)行凍存。此外，這些細(xì)胞需要進(jìn)行QC檢測(cè)，以確保其純度和安全性。一般來說，這些細(xì)胞的QC檢測(cè)項(xiàng)目包括鑒定vEGFR-3熒光染色和支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等微生物的檢測(cè)。

小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞

小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)蘇操作：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2）將凍存小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細(xì)胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BIU-87(人膀胱癌細(xì)胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。

5）將小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）第二天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

應(yīng)用^[4-5]

小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞可以用于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞通過NIK調(diào)節(jié)B細(xì)胞淋巴結(jié)歸巢及SAPHO綜合征外周血γδT細(xì)胞相關(guān)研究

淋巴細(xì)胞歸巢過程的分子基礎(chǔ)是淋巴細(xì)胞與各組織、器官血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子的相互作用。其中,B細(xì)胞歸巢到淋巴結(jié)的過程需要通過高內(nèi)皮小靜脈在趨化因子(尤其是CXCL13)的指導(dǎo)下完成。然而,CXCL13并不是由高內(nèi)皮小靜脈直接產(chǎn)生,其如何介導(dǎo)B細(xì)胞歸巢到淋巴結(jié)的分子機(jī)制目前還未闡明。NF-κB信號(hào)通路參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等多種生物進(jìn)程。NIK作為非經(jīng)典NF-κB途徑的關(guān)鍵分子也在維持完整的淋巴系統(tǒng)功能,特別是在維持完整的淋巴結(jié)和B細(xì)胞群,發(fā)揮重要作用。但對(duì)于其在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用仍不甚明了,本研究旨在探索淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中的NIK分子對(duì)于淋巴管功能的影響及其分子機(jī)制。

方法:本研究將NIK-flox小鼠與Lyvel EGFP-hCre小鼠交配繁育出淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞條件性敲除NIK的小鼠(NIKLEC-KO,NIKfl/flLyvel+/Cre)及同窩對(duì)照的野生型(NIK+/+Lyvel+/Cre)小鼠。

首先通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)小鼠的免疫器官進(jìn)行表型分析,并通過耳部淋巴回流功能檢測(cè)和異硫氰酸熒光素著色實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)NIKLEC-KO小鼠淋巴管引流液體和運(yùn)輸樹突狀細(xì)胞的功能。然后利用體內(nèi)歸巢實(shí)驗(yàn)檢測(cè)主要細(xì)胞亞群的歸巢情況。

通過RT-qPCR分析相關(guān)趨化因子的表達(dá),最后免疫小鼠通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)小鼠的抗體分泌能力以評(píng)價(jià)其體液免疫功能。

結(jié)果:在本研究中,發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)非經(jīng)典NF-κB途徑活化的激酶NIK對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的B細(xì)胞歸巢到淋巴結(jié)發(fā)揮了重要作用。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞條件性敲除NIK的小鼠并未表現(xiàn)出淋巴管的完整性破壞或整體功能的異常,但卻表現(xiàn)出淋巴結(jié)中的B細(xì)胞比例顯著降低。而在該小鼠脾臟中并未出現(xiàn)B細(xì)胞比例及生存狀態(tài)的異常。B細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除NIK使淋巴結(jié)招募B細(xì)胞的功能發(fā)生障礙。此外,本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NIK介導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞CXCL13和CCL19的表達(dá)。

結(jié)論:NIK是通過調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生B細(xì)胞歸巢趨化因子CXCL13進(jìn)而使初始B細(xì)胞歸巢到淋巴結(jié)。

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