背景[1-3]
小鼠胰島細(xì)胞分離自胰島組織；小鼠胰島細(xì)胞是分布于胰外分泌部腺泡間的內(nèi)分泌細(xì)胞團(tuán)，遍布于胰的各部，分布不均，以胰尾最多。胰島大小不等，小的只有幾個(gè)細(xì)胞，大的有數(shù)百個(gè)細(xì)胞。此外也有零散的內(nèi)分泌細(xì)胞位于腺泡和導(dǎo)管附近。胰島由薄層網(wǎng)狀纖維組成的被膜包被，但被膜并不完全。胰島的細(xì)胞配布成索，細(xì)胞索間毛細(xì)血管豐富。細(xì)胞比腺泡細(xì)胞小，呈多邊形和圓形，大小不等，胞質(zhì)染色淺。核圓，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)顆粒較密，小鼠胰島細(xì)胞研究在糖尿病研究中具有重要價(jià)值。
小鼠胰島細(xì)胞
小鼠胰島細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)的方法：
1. 將小鼠仰臥位放置在解剖鏡下，酒精消毒皮膚，從腹部恥骨到前腿做V形切口。將皮膚折疊到胸部，暴露腹腔。
2. 將鼠的頭部朝向操作者，定位膽總管的十二指腸入口，用止血鉗夾住十二指腸開口。阻止灌入的酶液流入至腸道。
3. 掀起肝臟暴露膽總管，使用27 G針頭的注射器自膽總管灌流酶液，注意針頭掰彎成70度角，緩緩灌入酶液。當(dāng)2毫升的酶液充滿胰腺時(shí)，十二指腸附近的區(qū)域開始首先擴(kuò)張，接著是胃頂部的區(qū)域，最后是脾尾。最終使整個(gè)胰腺的均勻擴(kuò)張。
4. 一旦胰腺被灌注完成，就可以將胰腺從腸，胃和脾臟周圍慢慢拉出腹腔。放入50毫升錐形管中，放在冰上。不建議將灌注的胰腺放在冰上超過1小時(shí)。
5. 將再懸浮的組織通過直徑0.419毫米鋼絲網(wǎng)過濾倒入新鮮10%FBS培養(yǎng)基的50ml離心管中。4℃離心管800rpm離心2分鐘。
小鼠胰島細(xì)胞培養(yǎng)方法
小鼠胰島細(xì)胞是一種貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈梭形、多角形樣，不建議傳代；建議您收到細(xì)胞后盡快進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作。
1.取出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。
2.貼壁細(xì)胞消化
1)吸出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；
2)添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至T25培養(yǎng)瓶中，輕微轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37℃溫浴1-3min；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后，再加入5ml完全培養(yǎng)基終止消化；
3)用吸管輕輕吹打混勻，按傳代比例接種T25培養(yǎng)瓶傳代，然后補(bǔ)充新鮮的完全培養(yǎng)基至5mL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；
4)待小鼠胰島細(xì)胞完全貼壁后，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的完全培養(yǎng)基。
應(yīng)用[4-5]
小鼠胰島細(xì)胞可以用于基于小鼠胰島β細(xì)胞系MIN6構(gòu)建兩種常用胰島體外模型的比較研究
基于小鼠胰島β細(xì)胞系Min6細(xì)胞構(gòu)建無支架的細(xì)胞球和封裝于海藻酸凝膠中的分散細(xì)胞二種不同的三維(three-dimensional,3D)細(xì)胞培養(yǎng)體系。與傳統(tǒng)的二維(two-dimensional,2D)貼壁細(xì)胞相比,比較這三種培養(yǎng)方式下胰島素分泌功能的差異并對(duì)其存在的機(jī)制進(jìn)行初步的研究。
方法:(1)采用Solid-works設(shè)計(jì)出深度、直徑可調(diào)的模具,利用3D打印技術(shù)制備出模具,并構(gòu)建瓊脂糖微孔矩陣培養(yǎng)3D Min6細(xì)胞球;
(2) 采用海藻酸鈉封裝MIN6細(xì)胞構(gòu)建3D細(xì)胞微囊,采用Calcein AM/PI死活染色檢測(cè)不同濃度的海藻酸鈉水凝膠以及解交聯(lián)劑對(duì)MIN6細(xì)胞微囊存活的影響;
(3) 采用Cell Titer-Glo(?)3D化學(xué)發(fā)光法評(píng)估MIN6細(xì)胞在不同濃度的海藻酸鈉水凝膠以及2D,3D培養(yǎng)下的增殖差異;
(4) 掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞球和海藻酸鈉微囊的表面特征。
(5) 實(shí)驗(yàn)分組:2D組、細(xì)胞球組、細(xì)胞微囊組;
(6) Western blot、IF、RT-q PCR分別檢測(cè)Min6細(xì)胞胰島功能相關(guān)蛋白GLUT2、PDX1、Insulin(INS)和基因GLUT2、PDX1、INS2、NKX2.2的表達(dá)差異;
(7) 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISA檢測(cè)葡萄糖刺激Min6細(xì)胞下的胰島素分泌差異;(8)Western Blot檢測(cè)三種培養(yǎng)方式下胰島素分泌相關(guān)信號(hào)通路PI3K/AKT/FoxO1的表達(dá)變化;(9)Western Blot檢測(cè)不同濃度的海藻酸鈉封裝的細(xì)胞胰島素分泌相關(guān)信號(hào)通路PI3K/AKT/FoxO1的表達(dá)變化。
結(jié)果:(1)瓊脂糖表面可形成整齊排列的微孔矩陣,MIN6細(xì)胞在微孔內(nèi)可聚集形成大小均一,緊密的細(xì)胞球。
(2) 死活染色與增殖結(jié)果顯示,1%(w/v)海藻酸鈉水凝膠裝封適合MIN6細(xì)胞生長(zhǎng)。
(3) 增殖檢測(cè)結(jié)果顯示,二種3D培養(yǎng)均能有效促進(jìn)MIN6細(xì)胞的增殖。
(4) 掃描電鏡結(jié)果顯示,細(xì)胞球之間細(xì)胞互相融合、緊密聚集成微組織,細(xì)胞在水凝膠基質(zhì)上形成單層簇狀或多細(xì)胞簇狀在局部生長(zhǎng)。
(5) 免疫熒光結(jié)果顯示,GLUT2,PDX1,INS的信號(hào)強(qiáng)度,細(xì)胞球組最明顯,水凝膠組和2D組差異不明顯。
(6) ELISA結(jié)果顯示高糖或低糖刺激下,與2D相比,3D培養(yǎng)促進(jìn)胰島素分泌量更高(P<0.05),其中水凝膠組胰島素分泌高于細(xì)胞球組(P<0.05)。
(7) RT-q PCR結(jié)果顯示,3D培養(yǎng)有利于促進(jìn)GLUT2、PDX1、INS2和NKX2.2基因的表達(dá),其中水凝膠組對(duì)基因表達(dá)的上調(diào)作用(P<0.001)。
(8) Western blot結(jié)果顯示,MIN6細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下,GLUT2的表達(dá)無顯著性差異,PDX1,INS表達(dá)趨勢(shì)和RT-q PCR一致。
(9) Western blot結(jié)果顯示,PI3K,p-AKT/AKT,p-FoxO1/FoxO1和PDX1蛋白的表達(dá)水平,水凝膠組明顯高于其他兩組(P<0.05)。其中,細(xì)胞球組的表達(dá)水平也比2D組高,統(tǒng)計(jì)沒有顯著差異。
(10)不同濃度水凝膠封裝MIN6細(xì)胞,Western blot結(jié)果顯示,PI3K的表達(dá),0.5%和1%(w/v)差異不明顯,2%(w/v)的顯著降低(P<0.05);p-AKT/AKT,p-FoxO1/FoxO1,PDX1的表達(dá)1%表達(dá)最高(P<0.05),0.5%和2%(w/v)之間無顯著性差異。
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