水楊酸及其衍生物在醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,但由于其有毒且自然降解時(shí)間長(zhǎng),會(huì)影響自然生態(tài)平衡和人類健康,因此,研究其降解方法對(duì)于實(shí)現(xiàn)綠色生產(chǎn)具有重要意義和必要性。而且,水楊酸及其衍生物的脫羧產(chǎn)物——苯酚及其衍生物,也是重要的有機(jī)化工原料,在化學(xué)工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)有著廣泛的應(yīng)用,既可作為化學(xué)合成的中間體,也是重要的化學(xué)藥品原料。
4-氨基水楊酸在40℃以上的水溶液中不穩(wěn)定,分解并放出二氧化碳而成為間氨基酚?,F(xiàn)有技術(shù)中分解4-氨基水楊酸主要依靠加熱手段,工廠化應(yīng)用會(huì)耗費(fèi)大量熱能,并且隨著逆反應(yīng)的進(jìn)行而使分解效率低下。
發(fā)明內(nèi)容
為了解決以上技術(shù)問題,本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種酶法降解4-氨基水楊酸的方法,包括以下步驟:
Ⅰ、提取并擴(kuò)增水楊酸脫羧酶Sdc基因;在LB液體培養(yǎng)基中活化絲孢酵母并從絲孢酵母菌株中提取Sdc基因;經(jīng)過PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增Sdc基因;
Ⅱ、制作含有Sdc基因的重組質(zhì)粒;對(duì)PCR擴(kuò)增后Sdc基因及載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,并在DNA連接酶作用下16℃過夜培養(yǎng),其中Sdc基因與載體質(zhì)粒的體積比為3:1;
Ⅲ、構(gòu)建Sdc大腸桿菌表達(dá)菌株,誘導(dǎo)表達(dá);將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,37℃過夜培養(yǎng);
Ⅳ、超聲破碎Sdc大腸桿菌,純化水楊酸脫羧酶;對(duì)Sdc大腸桿菌的二級(jí)種子液進(jìn)行-80℃冰浴超聲破碎制得粗酶液,其中,在100W條件下超聲破碎3s,間歇3s,重復(fù)200個(gè)循環(huán);粗酶液經(jīng)0.45μm濾膜過濾,后通過鎳柱純化、透析得到水楊酸脫羧酶的精酶液;
Ⅴ、設(shè)置反應(yīng)箱及反應(yīng)體系;利用質(zhì)譜法計(jì)算酶活;向反應(yīng)箱中添加反應(yīng)體系,包括1L PBS緩沖液、0.6~0.8g/L精酶液、0.1~0.3g/L氯化亞鐵及 18~25g/L底物4-氨基水楊酸,并使反應(yīng)體系的pH為4.0~5.0,溫度為25~ 30℃;反應(yīng)箱的上端設(shè)置排氣口,排氣口內(nèi)安裝抽氣泵,將反應(yīng)箱內(nèi)的氣體抽到外部環(huán)境中。
此方法的優(yōu)勢(shì)
本發(fā)明取代傳統(tǒng)降解4-氨基水楊酸需經(jīng)高溫的技術(shù)條件,使分解反應(yīng)更易進(jìn)行且能耗更低、降解效率更高;利用基因工程使水楊酸脫羧酶的應(yīng)用工業(yè)化,提高單位時(shí)間內(nèi)的代謝產(chǎn)量;配制代謝效率最高的反應(yīng)體系,反應(yīng)體系中加入的氯化亞鐵,在反應(yīng)箱上設(shè)置抽氣泵,可提高酶反應(yīng)活性,并且防止逆反應(yīng)的發(fā)生,提升分解效率;質(zhì)譜法測(cè)量酶活相比現(xiàn)有技術(shù)的比色法更加準(zhǔn)確。