水楊酸及其衍生物在醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，但由于其有毒且自然降解時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)影響自然生態(tài)平衡和人類健康，因此，研究其降解方法對(duì)于實(shí)現(xiàn)綠色生產(chǎn)具有重要意義和必要性。而且，水楊酸及其衍生物的脫羧產(chǎn)物——苯酚及其衍生物，也是重要的有機(jī)化工原料，在化學(xué)工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)有著廣泛的應(yīng)用，既可作為化學(xué)合成的中間體，也是重要的化學(xué)藥品原料。

4-氨基水楊酸在40℃以上的水溶液中不穩(wěn)定，分解并放出二氧化碳而成為間氨基酚?，F(xiàn)有技術(shù)中分解4-氨基水楊酸主要依靠加熱手段，工廠化應(yīng)用會(huì)耗費(fèi)大量熱能，并且隨著逆反應(yīng)的進(jìn)行而使分解效率低下。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種酶法降解4-氨基水楊酸的方法，包括以下步驟：

Ⅰ、提取并擴(kuò)增水楊酸脫羧酶Sdc基因；在LB液體培養(yǎng)基中活化絲孢酵母并從絲孢酵母菌株中提取Sdc基因；經(jīng)過PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增Sdc基因；

Ⅱ、制作含有Sdc基因的重組質(zhì)粒；對(duì)PCR擴(kuò)增后Sdc基因及載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，并在DNA連接酶作用下16℃過夜培養(yǎng)，其中Sdc基因與載體質(zhì)粒的體積比為3:1；

Ⅲ、構(gòu)建Sdc大腸桿菌表達(dá)菌株，誘導(dǎo)表達(dá)；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，37℃過夜培養(yǎng)；

Ⅳ、超聲破碎Sdc大腸桿菌，純化水楊酸脫羧酶；對(duì)Sdc大腸桿菌的二級(jí)種子液進(jìn)行-80℃冰浴超聲破碎制得粗酶液，其中，在100W條件下超聲破碎3s，間歇3s，重復(fù)200個(gè)循環(huán)；粗酶液經(jīng)0.45μm濾膜過濾，后通過鎳柱純化、透析得到水楊酸脫羧酶的精酶液；

Ⅴ、設(shè)置反應(yīng)箱及反應(yīng)體系；利用質(zhì)譜法計(jì)算酶活；向反應(yīng)箱中添加反應(yīng)體系，包括1L PBS緩沖液、0.6～0.8g/L精酶液、0.1～0.3g/L氯化亞鐵及 18～25g/L底物4-氨基水楊酸，并使反應(yīng)體系的pH為4.0～5.0，溫度為25～ 30℃；反應(yīng)箱的上端設(shè)置排氣口，排氣口內(nèi)安裝抽氣泵，將反應(yīng)箱內(nèi)的氣體抽到外部環(huán)境中。

此方法的優(yōu)勢(shì)

本發(fā)明取代傳統(tǒng)降解4-氨基水楊酸需經(jīng)高溫的技術(shù)條件，使分解反應(yīng)更易進(jìn)行且能耗更低、降解效率更高；利用基因工程使水楊酸脫羧酶的應(yīng)用工業(yè)化，提高單位時(shí)間內(nèi)的代謝產(chǎn)量；配制代謝效率最高的反應(yīng)體系，反應(yīng)體系中加入的氯化亞鐵，在反應(yīng)箱上設(shè)置抽氣泵，可提高酶反應(yīng)活性，并且防止逆反應(yīng)的發(fā)生，提升分解效率；質(zhì)譜法測(cè)量酶活相比現(xiàn)有技術(shù)的比色法更加準(zhǔn)確。