背景[1-7]
酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種最經(jīng)濟高效的真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，可以成功實現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá)或是分泌表達(dá)，且其放大培養(yǎng)基相對廉價，培養(yǎng)條件要求不高，適宜工業(yè)放大。與哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)一樣，酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)λ磉_(dá)蛋白進行例如糖基化、?；?、脂基化、磷酸基化等保證蛋白天然構(gòu)象的修飾，可用于制備非常接近天然蛋白的具有高附加值的蛋白原料。
酵母是從重組DNA產(chǎn)生蛋白質(zhì)的常見宿主。它們提供相對容易的遺傳操作，并在廉價培養(yǎng)基上快速生長至高細(xì)胞密度。作為真核生物，它們能夠進行蛋白質(zhì)修飾，如在真核細(xì)胞中常見的糖基化，但在細(xì)菌中相對罕見。因此，酵母可以產(chǎn)生與來自植物或哺乳動物的天然產(chǎn)物相同或非常相似的復(fù)雜蛋白質(zhì)。
個酵母表達(dá)平臺基于面包酵母釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。然而在已經(jīng)研究了各種酵母表達(dá)系統(tǒng)，并且基于它們的不同特征和能力廣泛用于各種應(yīng)用。例如，它們中的一些生長在廣泛的碳源基上，并且不限于葡萄糖，就像面包酵母一樣。其中一些也應(yīng)用于基因工程和外源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。各種酵母表達(dá)平臺在若干特征方面不同，包括它們的生產(chǎn)力以及在特定實例中分泌，加工和修飾蛋白質(zhì)的能力。但是，所有表達(dá)平臺的使用都有一些基本的相似之處。
應(yīng)用[8]
利用酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)制備外源基因的表達(dá)產(chǎn)物已有十余年的歷史,其中的S.cerevisiae表達(dá)系統(tǒng)和P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)最受人們的青睞。截止目前,利用酵母表達(dá)系統(tǒng)人們已經(jīng)成功地表達(dá)了多種生物(包括細(xì)菌、真菌、病毒、原生生物、植物、脊椎動物、人類)的許多蛋白質(zhì),涉及酶類、蛋白酶體、蛋白酶體抑制物、受體、單鏈抗體、抗原、調(diào)控蛋白等多種蛋白質(zhì)。
在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,酵母表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成功地應(yīng)用于基因工程疫苗制備、基因工程藥物制備(如抗體藥物、蛋白質(zhì)藥物)和蛋白質(zhì)功能研究等。國外,用于肌萎縮側(cè)索硬化治療的胰島素樣生長因子1(IGF-1)和血清代用品人血清白蛋白(HSA)已經(jīng)通過了臨床實驗,正在等待FDA批準(zhǔn)即可進入臨床使用。
1.CoMed載體系統(tǒng)的設(shè)計和功能
CoMed基本載體包含用于在大腸桿菌系統(tǒng)中繁殖的所有大腸桿菌元件和用于整合ARS，rDNA，選擇標(biāo)記和表達(dá)盒模塊的MCS（多克隆ste）。ARS片段的側(cè)翼是Sac II和Bcu I限制性位點，Bcu I和Eco 47III限制性位點的rDNA區(qū)域，Eco 47III和SalI限制性位點的選擇標(biāo)記以及Sal I和Apa I限制性位點的啟動子元件。為了產(chǎn)生所需產(chǎn)物，用載體轉(zhuǎn)化合適的酵母菌株，所述載體含有用于產(chǎn)生目的生物產(chǎn)物的所有必需遺傳元件。
載體還必須含有選擇標(biāo)記，選擇標(biāo)記需要從已經(jīng)成功攝取過的載體中選擇酵母。載體還含有某些DNA元件，允許酵母將外源DNA摻入酵母的染色體中并復(fù)制它。最重要的是，載體含有負(fù)責(zé)產(chǎn)生所需化合物的區(qū)段，稱為表達(dá)盒。表達(dá)盒包含一系?列調(diào)節(jié)元件，用于控制最終制造某種產(chǎn)品的程度和程度。接下來是生物產(chǎn)品本身的基因。表達(dá)盒由終止子序列終止，終止子序列停止表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄。
2.常用酵母表達(dá)系統(tǒng)
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表達(dá)系統(tǒng)、甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)、裂殖酵母(Schizogenesis pombe)表達(dá)系統(tǒng)。以巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因為例,包括如下步驟:
將目的基因克隆入畢赤酵母表達(dá)載體,收獲陽性重組表達(dá)質(zhì)粒用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化陽性重組質(zhì)粒,使之線性化將線性化的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母菌株(如GS115,KM 71)將轉(zhuǎn)化物接種HIS4缺陷平板進行輪篩選用不同濃度的G418平板進行第二輪篩選挑選10～20個克隆進行小規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng),鑒定外源基因的表達(dá)量，挑選高水平表達(dá)菌株進行大規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng),以制備外源基因的表達(dá)蛋白質(zhì)。
參考文獻
[1] Cereghino JL et al.FEMS Microbiol Rev,2000,24(1):45—66
[2] Zhu H et al.Biochem Biophys Res Com mun,1997,239(2):498—502
[3] Lopes TS et al.Gene,1991,105(1):83—90
[4] Gellissen G et a l.Trend s Biotech nol,1992,10(12):413—417
[5] Scorer CA et al.B iotech nology(NY),1994,12:181—184
[6] Shen S et a l.Gene,1998,216:93-102
[7] Cereghino GP et al.Curr Opin Biotechnol,1999,10(5):422—427
[8]吳麗娟,蔣建新,朱佩芳,王正國,康格非.酵母表達(dá)系統(tǒng)及其應(yīng)用研究[J].生命的化學(xué),2003(01):46-49.