背景^[1-7]

大腸桿菌屬于大腸菌群屬兼性厭氧革蘭氏陰性菌，大腸桿菌是通常生活在生物腸道中。大多數(shù)大腸桿菌菌株是無害的，但某些血清型可導(dǎo)致宿主嚴(yán)重的食物中毒。

無害大腸桿菌是腸道正常微生物群的一部分與生物體為共生關(guān)系，可以通過產(chǎn)生維生素K 2使機體受益，并防止病原菌在腸道增殖。大腸桿菌是個用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌,它不僅具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、生長繁殖快、成本低廉,可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點,而且其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過細(xì)菌總蛋白量的30%,因此大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。

大腸桿菌是最廣泛使用的表達(dá)宿主之一，并且DNA通常被引入質(zhì)粒表達(dá)載體中。在大腸桿菌中過表達(dá)的技術(shù)已得到很好的發(fā)展，并且通過增加基因拷貝數(shù)或增加啟動子區(qū)的結(jié)合強度來起作用，從而有助于轉(zhuǎn)錄。

例如，可以將目的蛋白質(zhì)的DNA序列克隆或亞克隆到含有l(wèi)ac啟動子的高拷貝數(shù)質(zhì)粒中，然后將其轉(zhuǎn)化到細(xì)菌大腸桿菌中。添加IPTG（乳糖類似物）激活lac啟動子并使細(xì)菌表達(dá)目的蛋白質(zhì)。

組成^[1-7]

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點培養(yǎng)周期短，目標(biāo)基因表達(dá)水平高，遺傳背景清楚，是目前應(yīng)用最為廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)涵蓋病毒蛋白，獸用疫苗，植物及水產(chǎn)研究用蛋白，細(xì)胞因子，酶類等方面。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的組成：表達(dá)載體、外源基因、表達(dá)宿主菌。

1.表達(dá)載體：

小型環(huán)狀DNA，能自我復(fù)制。一個完整的質(zhì)粒載體必須要有復(fù)制起點、啟動子、插入的目的基因、篩選標(biāo)記以及終止子；此外對大腸桿菌表達(dá)載體的要求是：①操縱子以及相應(yīng)的的調(diào)控序列，外源基因產(chǎn)物可能會對大腸桿菌有毒害作用；②SD序列，即核糖體識別序列，一般SD序列與起始密碼子之間間隔7-13bp翻譯效率最高；③多克隆位點以便目的基因插入到適合位置。

2.外源基因：

在大腸桿菌表達(dá)體系中要表達(dá)的基因即外源基因，包括原核基因和真核基因；原核基因可以在大腸桿菌中直接表達(dá)出來，但是真核基因韓有內(nèi)含子不能，大腸桿菌不能對mRNA進(jìn)行剪切，從而形成成熟的mRNA，所以真核基因一般以cDNA的形式在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。此外還需提供大腸桿菌能識別的且能轉(zhuǎn)錄翻譯真核基因的元件。

3.表達(dá)宿主菌：

表達(dá)蛋白的生物體即大腸桿菌。表達(dá)宿主菌的選擇在大腸桿菌蛋白表達(dá)過程中是很重要的因素——多數(shù)人會直接選擇實驗室曾經(jīng)用過的宿主菌，而不去追究原因。對于宿主菌的選擇主要根據(jù)宿主菌各自的特征及目的蛋白的特性，例如目的蛋白需要形成二硫鍵，可以選擇Origami 2系列，Origami能顯著提高細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率，促進(jìn)蛋白可溶性及活性表達(dá)；目的蛋白含有較多稀有密碼子可用Rosetta 2系列，補充大腸桿菌缺乏的七種（AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA及CGG）稀有密碼子對應(yīng)的tRNA，提高外源基因的表達(dá)水平。

應(yīng)用^[8]

人乳頭瘤病毒18型病毒樣顆粒在大腸桿菌中的表達(dá)及免疫原性分析：利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可溶性表達(dá)人乳頭瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,經(jīng)過純化和重組裝過程獲得HPV18病毒樣顆粒(VLPs),研究其免疫原性和誘發(fā)中和抗體生成的水平。

首先,提取HPV18的基因組DNA,通過PCR擴增獲得HPV18 L1基因片段,將其插入pTrxFus表達(dá)載體,在大腸桿菌中可溶性表達(dá)HPV18 L1蛋白;其次,通過硫酸銨沉淀、離子交換層析和疏水相互作用層析獲得高純度的HPV18 L1蛋白,而后透析去除預(yù)先加入的還原劑DTT,使HPV18 L1蛋白自發(fā)組裝成VLPs;最后,通過動態(tài)光散射技術(shù)和透射電子顯微鏡鑒定HPV18 VLPs的大小和形態(tài),利用假病毒細(xì)胞中和實驗評價HPV18 VLPs在實驗動物體內(nèi)的免疫原性和中和抗體生成水平。

結(jié)果表明,HPV18L1蛋白可以在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中以可溶形式表達(dá),經(jīng)過純化的HPV18 L1蛋白可以自發(fā)組裝成為半徑約為29.34nm、與HPV病毒外觀相似的VLP。該VLPs在小鼠體內(nèi)的中和抗體半數(shù)有效劑量為0.006μg,在兔及山羊體內(nèi)誘導(dǎo)中和抗體滴度高達(dá)107?？傊?本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)可簡便高效地獲得具有高度免疫原性的HPV18 VLPs,為HPV18預(yù)防性疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ),具有重要的應(yīng)用意義。

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