背景[1-3]
NIH3T3與原始的隨機(jī)交配3T3和近交系BALB/c 3T3建株方法一樣，NIH/3T3，是從NIH Swiss小鼠胚胎培養(yǎng)物中建立的高度接觸抑制的連續(xù)細(xì)胞株。為了培育在形態(tài)學(xué)特征上更適合于進(jìn)行轉(zhuǎn)化分析的亞株，建立的NIH/3T3細(xì)胞株又進(jìn)行了五輪以上亞克隆。這株細(xì)胞對(duì)DNA轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)染研究十分有用。該細(xì)胞易于轉(zhuǎn)染，對(duì)肉瘤病毒轉(zhuǎn)化灶形成和白血病病毒增殖十分敏感。檢測(cè)表明肢骨發(fā)育畸形病毒(鼠痘)陰性。
NIH3T3
NIH/3T3是從NIHSwiss小鼠胚胎培養(yǎng)物中建立的高度接觸性抑制的連續(xù)傳代細(xì)胞株。為了培育在形態(tài)學(xué)特征上更適合于進(jìn)行轉(zhuǎn)化分析的亞株，建立的NIH/3T3細(xì)胞株又進(jìn)行了5輪以上亞克隆。該細(xì)胞株對(duì)肉瘤病毒的轉(zhuǎn)化灶形成和白血病病毒的繁殖高度敏感，對(duì)DNA轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)染研究十分有用。
NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇NIH3T3細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）NIH3T3細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）NIH3T3細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為類(lèi)；
1.NIH3T3細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4][5]
NIH3T3可以用于原花青素對(duì)TGF-β誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞增殖及分化的影響
探討原花青素對(duì)受TGF-β1誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞增殖及分化影響,并探討其對(duì)PI3K/AKT通路的影響,為肺纖維化早期藥物干預(yù)研究提供新思路及相關(guān)依據(jù)。
方法:將在體外培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,貼壁生長(zhǎng))作為研究對(duì)象,在體外適宜條件下培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞接種在96孔板中待細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分為五組,A組(空白對(duì)照組)不加LY294002(PI3K抑制劑)、原花青素或TGF-β1藥物;B組(TGF-β1組)僅僅加入5μg/L濃度的TGF-β1;C組(原花青素+TGF-β1組)先加入50μg/m L濃度的原花青素溶液預(yù)處理1h后,再加入TGF-β1(5μg/L);D組(LY294002+TGF-β1組)先加入10μmol/L濃度的LY294002作用1h后,再予以TGF-β1(5μg/L);E組(LY294002+原花青素+TGF-β1組)先加入LY294002(10μmol/L)作用1h,再加入原花青素(50μg/m L)作用1h,最后予以TGF-β1(5μg/L)。
以上五組經(jīng)不同處理的NIH3T3細(xì)胞在條件適宜的普通細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別于12、24、48 h點(diǎn)用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力情況;觀察記錄五組細(xì)胞形態(tài)上的變化并檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K、AKT的m RNA表達(dá)情況以及α-SMA、Col-I、ρ-PI3K、ρ-AKT各蛋白的表達(dá)情況。
結(jié)果:1、細(xì)胞形態(tài)觀察:倒置生物顯微鏡下可見(jiàn)A組為紡錘形或者星形的成纖維細(xì)胞,其余組可見(jiàn)扁平狀結(jié)構(gòu)的肌成纖維細(xì)胞,B組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在鏡下較為明顯。
2、CCK8檢測(cè)結(jié)果:B組細(xì)胞增殖活力在12、24、48 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于A組,C、D組細(xì)胞增殖活力在24、48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于A組但低于B組,E組細(xì)胞增殖活力在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于B組(差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05)。
3、WB結(jié)果示:加入藥物的B、C、D、E四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的α-SMA、Col-I的蛋白表達(dá)相比較于空白對(duì)照A組均有升高,C、D、E組此兩種蛋白表達(dá)均較B組低,E組中α-SMA蛋白相比C、D組表達(dá)水平更低(差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05),C、D兩組比較此兩種蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異。加入藥物的B、C、D、E四組實(shí)驗(yàn)組的ρ-PI3K、ρ-AKT的蛋白表達(dá)相比較于空白對(duì)照A組而言均有升高,四組實(shí)驗(yàn)組的蛋白表達(dá)水平由高到低依次為B組、C組、D組和E組(差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05)。
4、qRT-PCR結(jié)果顯示:加入藥物的B、C、D、E四組實(shí)驗(yàn)組的PI3K、AKT的m RNA表達(dá)相比較于空白對(duì)照A組而言均有升高,四組實(shí)驗(yàn)組的PI3K、AKT的m RNA表達(dá)水平由高到低依次為B組、C組、D組和E組(差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05)。
結(jié)論:原花青素可能通過(guò)下調(diào)TGF-β1-PI3K/AKT通路抑制NIH3T3細(xì)胞的增殖及分化。
參考文獻(xiàn)
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