背景技術(shù)

維生素A及其衍生物是維持人類與動(dòng)物的生長(zhǎng)與生命所不可缺少的物質(zhì)之一，人體缺乏維生素A，會(huì)出現(xiàn)皮膚干燥、脫屑和脫發(fā)等癥狀。最常用的維生素A衍生物是維生素A醋酸酯，其結(jié)構(gòu)式如下：

維生素A醋酸酯用于維生素A缺乏癥，該維生素為脂溶性，是調(diào)節(jié)上皮組織細(xì)胞生長(zhǎng)與健康的必須因子，使粗糙老化皮膚表面變薄，促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝正?；畎櫺Ч黠@。目前維生素A醋酸酯已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品添加劑、飼料添加劑及化妝品等行業(yè)，其制備合成一直備受關(guān)注。傳統(tǒng)的Isler合成工藝中，維生素A使用羥基維生素A醋酸酯在有機(jī)溶劑中預(yù)冷至-55℃～-65℃，用質(zhì)量濃度≥61％的氫溴酸將其羥基溴代，然后再脫溴形成共軛雙鍵得到維生素A醋酸酯成品，其具體反應(yīng)過(guò)程如下所示：

然而，采用該方法存在以下缺點(diǎn)：

(1)反應(yīng)路線長(zhǎng)，包括上溴、脫溴兩步反應(yīng)，實(shí)際工藝化生產(chǎn)還需多次分層萃取，操作步驟繁瑣，且會(huì)產(chǎn)生大量廢水；

(2)需使用其他多種輔料，其中高濃度的氫溴酸具有強(qiáng)腐蝕性，操作危險(xiǎn)性大，且設(shè)備易被腐蝕；

(3)上溴反應(yīng)需在超低溫條件下反應(yīng)，能耗高；

(4)整個(gè)反應(yīng)過(guò)程對(duì)溫度及pH值的控制要求極高，易操作失誤，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量和外觀。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)羥基維生素A醋酸酯脫水生成維生素A醋酸酯合成方法中所存在的以上問(wèn)題，而提供一種簡(jiǎn)單高效、產(chǎn)品收率較高、質(zhì)量較好的維生素A醋酸酯的合成方法。

具體地，本發(fā)明提供了一種維生素A醋酸酯的合成方法，其中，該方法包括將羥基維生素A醋酸酯在有機(jī)溶劑中以脫水酶作為催化劑進(jìn)行脫水反應(yīng)，使得羥基維生素A醋酸酯脫去一份子水并形成共軛雙鍵。

優(yōu)選地，所述脫水酶產(chǎn)自有機(jī)體假單胞菌屬、黃桿菌屬、乳桿菌屬、金黃桿菌屬、鏈球菌屬和芽孢桿菌屬中的至少一種菌屬，更優(yōu)選產(chǎn)自嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、嗜冷黃桿菌、植物乳桿菌、腦膜膿毒金黃桿菌、釀膿鏈球菌和紡錘形賴氨酸芽孢桿菌中的至少一種菌種。

優(yōu)選地，所述脫水酶按照以下方法獲得：通過(guò)克隆或化學(xué)合成法從所述菌屬或菌種中獲得酶基因，將該酶基因引入原核表達(dá)載體中得到重組載體，之后將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌得到重組菌株，所述重組菌株經(jīng)發(fā)酵、分離純化后得到所述脫水酶；所述酶基因的基因序列為SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。

優(yōu)選地，所述發(fā)酵的方式為將所述重組菌株在含有50～200μg/mL氨芐青霉素的培養(yǎng)基中于25～40℃、100～300rpm條件下震蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8，往菌液中加入誘導(dǎo)劑至終濃度為0.8～1.2mM，繼續(xù)培養(yǎng)20～30h。

優(yōu)選地，所述分離純化的方式為將發(fā)酵菌液于0～5℃、5000～7000rpm條件下離心分離，棄去上清液，收集菌體，并將收集的菌體重新懸浮于Tris-HCl緩沖液中，超聲波破碎后，于0～5℃、5000～7000rpm條件下再次離心分離，收集上層酶液，該酶液即為脫水酶。

優(yōu)選地，所述脫水酶以固定化酶的形式使用，所述固定化酶包括載體材料以及吸附在所述載體材料上的脫水酶，且所述脫水酶與載體材料的重量比為(1～5)mg:1g。選地，所述脫水酶與載體材料的重量比為2mg:1g。

優(yōu)選地，所述固定化酶采用將脫水酶與載體材料在室溫下于搖床中固定化反應(yīng)5-20小時(shí)，之后再洗滌干燥制得。

優(yōu)選地，所述載體材料選自硅藻土、活性炭、多孔玻璃、硅膠和氧化鋁中的至少一種，選為硅藻土。

優(yōu)選地，當(dāng)所述脫水酶未固定化使用時(shí)，則所述羥基維生素A醋酸酯、有機(jī)溶劑和酶的用量比為10g︰(50～150)mL:(15～50)mg；當(dāng)所述脫水酶以固定化酶的形式使用時(shí)，則所述羥基維生素A醋酸酯、有機(jī)溶劑和固定化酶的用量比為10g︰(50～150)mL:(3～10)g。

優(yōu)選地，所述脫水反應(yīng)在減壓共沸蒸餾條件下進(jìn)行。

優(yōu)選地，所述脫水反應(yīng)的溫度為20～70℃，更優(yōu)選為30℃～60℃；時(shí)間為4h～10h，更優(yōu)選為5h～8h。

優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑選自C5～C8的烷烴、C5～C8的環(huán)烷烴、C1～C8的鹵代烴和C6～C10的芳香烴中的至少一種。

優(yōu)選地，所述C5～C8的烷烴選自正己烷、正庚烷和正戊烷中的至少一種。

優(yōu)選地，所述C5～C8的環(huán)烷烴為環(huán)己烷。

優(yōu)選地，所述C1～C8的鹵代烴為二氯甲烷和/或1-氯己烷。

優(yōu)選地，所述C6～C10的芳香烴選自苯、甲苯和二甲苯中的至少一種。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供的維生素A醋酸酯的合成方法還包括在所述脫水反應(yīng)之后，將所得反應(yīng)液冷卻后過(guò)濾，所得濾渣作為脫水酶回用，所得濾液經(jīng)減壓蒸發(fā)有機(jī)溶劑之后得到維生素A醋酸酯。

優(yōu)選地，所述冷卻之后反應(yīng)液的溫度降至20℃以下。

優(yōu)選地，所述減壓蒸發(fā)的條件包括溫度為50℃～60℃，壓力為-0.060～-0.099MPa。

本發(fā)明提供的合成方法反應(yīng)條件溫和、能耗低、無(wú)副反應(yīng)、無(wú)廢水、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)收率高，并且產(chǎn)品純度高、質(zhì)量好，避免了前述維生素A醋酸酯合成方法存在的缺陷。

采用本發(fā)明提供的方法合成的維生素A醋酸酯，外觀為黃色油狀物。采用《飼料中維生素A的測(cè)定高效液相色譜法(GB/T 17817-2010)》的檢測(cè)方法分析，效價(jià)＞250萬(wàn)IU/g，折純收率可達(dá)92％以上，可廣泛用作藥物、飼料添加劑、食品添加劑等。

具體實(shí)施方式

該制備例用于說(shuō)明本發(fā)明提供的脫水酶的合成。

(1)酶合成：將腦膜膿毒金黃桿菌的酶基因(由生工生物工程(上海)股份有限公司化學(xué)合成獲得，所述酶基因的基因序列為SEQ ID NO:4)克隆到pET25載體內(nèi)，然后將所得重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)得到重組菌株，將該重組菌株在含有100μg/mL氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中于30℃、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6-0.8，之后往菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1mM，繼續(xù)培養(yǎng)24h。將菌液于4℃、6000rpm離心15min，棄去上清液，收集菌體。將收集的菌體重新懸浮于Tris-HCl緩沖液(20mM Tris-HCl、300mM NaCl、pH值8.0)中，超聲波破碎后，于4℃、6000rpm離心15min，收集上層酶液(5mg/ml)，保存在4℃下。

(2)酶固定化：取2mL上述酶液(5mg/ml)與5g硅藻土(使用前活化處理，即于300℃～450℃烘干2～4h，下同)混勻后置于搖床中，室溫下振蕩吸附12h，吸去酶液，用20mM的Tris-HCl緩沖液(pH值8.0)洗滌3次，于50℃真空干燥24h，即得到固定化酶。用HPLC法檢測(cè)得到該固定化酶的活性為12000IU/g。