背景^[1-3]

葡萄糖銨培養(yǎng)基用于鑒別細(xì)菌利用銨鹽作為唯一氮源并分解葡萄糖的試驗(yàn)。

原理：氯化鈉維持均衡的滲透壓；硫酸鎂提供生長(zhǎng)必須的微量元素；磷酸氫二鉀是緩沖劑；能利用磷酸二氫銨作為唯一氮源且不需要尼克酸和氨基酸作為生長(zhǎng)因子的微生物分解葡萄糖使培養(yǎng)基變酸性；溴麝香草酚蘭是指示劑，產(chǎn)酸時(shí)培養(yǎng)基由綠色變?yōu)辄S色；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

葡萄糖銨培養(yǎng)基

使用方法：

1、稱取本品24.3g，加入蒸餾水或去離子水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝試管，121℃高壓滅菌15min，放成斜面。

2、用接種針輕輕觸及培養(yǎng)物的表面，在鹽水管內(nèi)做成極稀的懸液，肉眼觀察不見(jiàn)混濁，以每一接種環(huán)內(nèi)含菌數(shù)在20—100之間為宜。將接種環(huán)滅菌后挑取菌液接種，同時(shí)再以同法接種普通斜面一支作為對(duì)照。于36±1℃培養(yǎng)24h。

3、觀察結(jié)果：陽(yáng)性葡萄糖銨斜面上有正常大小的菌落生長(zhǎng)，陰性者不生長(zhǎng)，但在對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。如在葡萄糖銨生長(zhǎng)極微小的菌落可視為陰性結(jié)果。

質(zhì)量控制：

下列菌株接種本培養(yǎng)基后，于36±1℃培養(yǎng)24h，結(jié)果如下：

大腸埃希氏菌ATCC25922培養(yǎng)基變黃色

枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501不生長(zhǎng)培養(yǎng)基顏色不變

應(yīng)用^[4][5]

用于魯氏接合酵母產(chǎn)葡萄糖醛酸發(fā)酵條件優(yōu)化研究

從紅茶菌（Kombucha）中分離得到一株具有產(chǎn)葡萄糖醛酸能力的魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）ZSR2,通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化顯著提高了其產(chǎn)葡萄糖醛酸的水平,為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖醛酸的工業(yè)化進(jìn)程奠定了一定基礎(chǔ)。

主要研究結(jié)果如下:（1）產(chǎn)葡萄糖醛酸菌株的篩選。通過(guò)考察葡萄糖醛酸合成途徑關(guān)鍵酶活性,從紅茶菌和本研究室菌種庫(kù)中獲得了7株肌醇加氧酶（myo-inositol oxygenase,MIOX）活力較高的菌株:包括三株蠟樣芽孢桿菌H3、H4和H7、魯氏接合酵母ZSR2和ZQ01、假絲酵母Y3和米曲霉NRRL3448。經(jīng)驗(yàn)證,魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸能力最強(qiáng)(1.13g·L-1),因此選擇它作為生產(chǎn)菌株用于后續(xù)發(fā)酵優(yōu)化的研究。

（2）魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸發(fā)酵條件單因素考察和響應(yīng)面發(fā)酵優(yōu)化。通過(guò)單因素優(yōu)化確定了魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸的發(fā)酵條件為:發(fā)酵培養(yǎng)基含有80 g·L-1蔗糖、30 g·L-1大豆蛋白胨,培養(yǎng)基初始pH 5.0,種齡9 h,接種量為3%。在此條件下,魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸水平提高到14.68 g·L-1,是優(yōu)化前的3.8倍。利用響應(yīng)面法揭示了兩個(gè)極其顯著因素（大豆蛋白胨濃度和發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH）對(duì)葡萄糖醛酸產(chǎn)量的交互作用。采用預(yù)測(cè)的條件(大豆蛋白胨34.1 g·L-1,培養(yǎng)基初始pH為4.94)進(jìn)行試驗(yàn),魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸產(chǎn)量提高到15.62 g·L-1。

（3）提高魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸產(chǎn)量的其它優(yōu)化策略。本研究證實(shí),在培養(yǎng)基中添加紅茶粉或其功能性物質(zhì)綠原酸和茶皂素,添加提高M(jìn)IOX酶活物質(zhì)等策略,均可促進(jìn)ZSR2產(chǎn)酸。其中在培養(yǎng)基中添加3%紅茶粉,葡萄糖醛酸產(chǎn)量達(dá)到18.06g·L-1;添加2 mmol·L-1亞鐵離子和L-半胱氨酸,葡萄糖醛酸產(chǎn)量分別提高到19.32 g·L-1和20.68 g·L-1。此外,在發(fā)酵后期補(bǔ)加氮源有利于促進(jìn)產(chǎn)酸。在發(fā)酵第14 h補(bǔ)加單一無(wú)機(jī)氮源檸檬酸銨,魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸量提高到22.36 g·L-1,是補(bǔ)料前的1.5倍。

（4）魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸發(fā)酵優(yōu)化策略的3 L發(fā)酵罐發(fā)酵驗(yàn)證。通過(guò)組合在發(fā)酵過(guò)程中添加提高M(jìn)IOX酶活物質(zhì)和補(bǔ)加氮源等提高魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸量的策略,在搖瓶水平葡萄糖醛酸產(chǎn)量提高到26.79 g·L-1。在3 L發(fā)酵罐采用此優(yōu)化策略,發(fā)酵20 h魯氏接合酵母ZSR2產(chǎn)葡萄糖醛酸產(chǎn)量達(dá)到最高,為35.26 g·L-1。

參考文獻(xiàn)

[1]Different temperatures select distinctive acetic acid bacteria species and promotes organic acids production during Kombucha tea fermentation[J].Francesca De Filippis,Antonio Dario Troise,Paola Vitaglione,Danilo Ercolini.Food Microbiology.2018

[2]Synthesis of glucuronic acid derivatives via the efficient and selective removal of a C6 methyl group[J].Zhuang Hou,Yang Liu,Xin-xin Zhang,Xiao-wei Chang,Mao-sheng Cheng,Chun Guo.Tetrahedron Letters.2017(5)

[3]Lactic acid bacteria:promising supplements for enhancing the biological activities of kombucha[J].Nguyen Khoi Nguyen,Ngan Thi Ngoc Dong,Huong Thuy Nguyen,Phu Hong Le.SpringerPlus.2015(1)

[4]Adaptive response and tolerance to sugar and salt stress in the food yeast Zygosaccharomyces rouxii[J].Tikam Chand Dakal,Lisa Solieri,Paolo Giudici.International Journal of Food Microbiology.2014

[5]李益烽.魯氏接合酵母產(chǎn)葡萄糖醛酸發(fā)酵條件優(yōu)化[D].江南大學(xué),2019.