背景[1-3]
EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞由EHA101菌株改造而來(lái)(Hood et al.,1993)，為農(nóng)桿菌C58型背景，核基因中含有利福平抗性基因(Rif)。此菌株還攜帶一種自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能喪失的質(zhì)粒(disarmed Ti plasmid)。EHA105菌株含有胭脂堿型Ti質(zhì)粒pEHA105(pTiBo542DT-DNA),該質(zhì)粒含有vir基因(vir基因是TDNA插入植物基因組所必需的元件，pEHA105(pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可輔助植物雙元表達(dá)載體的T-DNA的轉(zhuǎn)移）。pEHA105(pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒還含有Str抗性基因，賦予EHA105菌株鏈霉素抗性。EHA105農(nóng)桿菌適用于水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。EHA105電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，經(jīng)pCAMBIA2301M質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率大于105 cfu/μg DNA。
EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞
操作方法：
1.電極間距為0.1cm的電轉(zhuǎn)杯（Gene Pulser®/MicroPulser™electroporation cuvettes）插入碎冰中，壓實(shí)冰面，冰中靜置5分鐘，使電轉(zhuǎn)杯充分降溫。（電轉(zhuǎn)杯重復(fù)使用方法：每次用完后，用大量的自來(lái)水沖洗干凈去掉菌液和DNA，用蒸餾水洗3遍，將其泡在75%乙醇中30分鐘，取出杯子，瀝干液體，放在超凈臺(tái)中，使乙醇充分揮發(fā)，蓋上蓋子放干燥地方備用。）
2.取-70℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入1μg質(zhì)粒DNA（洗脫或溶解質(zhì)粒的溶液中離子不能太高，或用雙蒸水稀釋），用手撥打管底混勻，立即插入冰中，在超凈臺(tái)中用無(wú)菌吸頭將感受態(tài)-質(zhì)?；旌衔锟焖僖频诫姄舯校w上杯蓋，空管保留待用。
3.啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置電擊參數(shù)：C=25μF，PC=200ohm，V=2400V（此參數(shù)為BioRad公司推薦，依據(jù)不同電轉(zhuǎn)儀設(shè)置針對(duì)農(nóng)桿菌合適的電擊參數(shù)）。用紙巾擦掉電轉(zhuǎn)杯外部的水分，將電轉(zhuǎn)杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中進(jìn)行電擊步驟。電擊完成后，將電轉(zhuǎn)杯快速插入冰中，加入700μl無(wú)抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到原來(lái)保留的感受態(tài)空管中，28℃，150-200 rpm振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)。
4.6000rpm離心一分鐘收菌，留取200μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊，取100μl的菌液涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天（當(dāng)平板只含有50μg/ml kan時(shí)，28℃培養(yǎng)48h即可；平板中同時(shí)加入50μg/ml kan，20μg/ml rif時(shí)，需28℃培養(yǎng)60h；如果使用的平板含有50μg/ml rif則需要28℃培養(yǎng)72-90h）。組成BC307-01EHA105 Electrocompetent cells 20×50μlpCAMBIA2301(1μg/μl)1支
應(yīng)用[4][5]
用于不同農(nóng)桿菌介導(dǎo)人胰島素基因轉(zhuǎn)化銀耳及ELISA法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物研究
在已初步建立的農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)銀耳轉(zhuǎn)基因方法的基礎(chǔ)上,以銀耳潮霉素敏感菌株Tr21-01為出發(fā)菌株,通過(guò)凍融法將攜帶有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（Hph）基因?yàn)檫z傳標(biāo)記及人胰島素基因（BAC）為目的基因的質(zhì)粒pBHg-BCA導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101,LBA4404和AGL-1中,并進(jìn)一步介導(dǎo)轉(zhuǎn)化銀耳進(jìn)行研究。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):AGL-1具有較高的轉(zhuǎn)化率;GV3101轉(zhuǎn)化率較低,且假陽(yáng)性較高;LBA4404無(wú)抗性菌落長(zhǎng)出。此結(jié)果表明不同的農(nóng)桿菌侵染銀耳芽孢能力具有差異性,且對(duì)受體侵染具有一定的特異性。
以農(nóng)桿菌EHA105為參照菌株,對(duì)農(nóng)桿菌AGL-1介導(dǎo)轉(zhuǎn)化銀耳進(jìn)行研究?；谵r(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因受諸多因素的影響,本實(shí)驗(yàn)從農(nóng)桿菌與銀耳芽孢共培養(yǎng)時(shí)間、銀耳芽孢濃度、農(nóng)桿菌濃度、誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮（AS）的濃度、轉(zhuǎn)化菌株陽(yáng)性比率等方面進(jìn)行優(yōu)化。
其轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化結(jié)果為:AGL-1菌液OD值為0.4～0.5,AS誘導(dǎo)培養(yǎng)濃度為250μg/mL、共培養(yǎng)濃度為150μg/mL,銀耳芽孢濃度為108/mL,共培養(yǎng)72h轉(zhuǎn)化率最高,可達(dá)500個(gè)/108,且陽(yáng)性菌落為89%;EHA105菌液OD值為0.4～0.5,AS誘導(dǎo)培養(yǎng)濃度為200μg/mL,共培養(yǎng)濃度為200μg/mL,銀耳芽孢濃度為108/mL,共培養(yǎng)48h轉(zhuǎn)化率最高,可達(dá)380個(gè)/108,且陽(yáng)性菌落為83%。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)AGL-1比EHA105有更高的轉(zhuǎn)化率。
通過(guò)上述轉(zhuǎn)基因方法,篩選到大量轉(zhuǎn)化子,隨機(jī)挑選26株轉(zhuǎn)化子通過(guò)ITS,Hph基因及BCA基因進(jìn)行DNA水平驗(yàn)證,同時(shí)隨機(jī)選取6株進(jìn)行Hph基因和BCA基因的cDNA水平驗(yàn)證。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:選取的轉(zhuǎn)化子都為陽(yáng)性菌株,并且檢測(cè)到Hph基因和BCA基因的mRNA。通過(guò)對(duì)60株轉(zhuǎn)基因菌株利用ELISA法對(duì)BCA目的基因進(jìn)行初步檢測(cè),結(jié)果表明部分菌株可以檢測(cè)到表達(dá)目的BCA基因的表達(dá)產(chǎn)物。
進(jìn)一步分析檢測(cè)得到的有目的BCA基因表達(dá)菌株發(fā)現(xiàn),其潮霉素抗性很高,大部分潮霉素抗性達(dá)350μg/mL。此結(jié)果說(shuō)明目BCA基因的表達(dá)與抗性基因Hph表達(dá)存在一定關(guān)系。
參考文獻(xiàn)
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