背景^[1-3]

辣根過氧化物酶HRP標記親和純化山羊抗兔IGG可以在Western檢測時催化ECL類試劑(如ECL、BeyoECL等)產(chǎn)生化學發(fā)光，可以在ELISA時催化TMB產(chǎn)生藍色，也可以在IHC或Western blot檢測時催化DAB產(chǎn)生棕色沉淀。

反應性該山羊抗兔二抗與兔IgG分子有特異性反應，與其它兔免疫球蛋白（包括IgM、IgE、IgD、IgA等）的輕鏈有交叉反應。該二抗與血清內(nèi)非免疫球蛋白無交叉反應，但可能與其它種屬的免疫球蛋白有交叉反應。

辣根過氧化物酶HRP標記親和純化山羊抗兔IGG

HRP（Horseradish Peroxidase，辣根過氧化物酶）是一種分子量達44000的糖蛋白，由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結合而成，通常來源于辣根植物中，是臨床檢驗試劑中的常用酶。辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。

HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。由于其易于提取、價格相對低廉，同時性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱及有機溶劑的作用，與抗原或抗體偶聯(lián)后，活性很少受損失，因此是迄今為止在免疫學中應用最為廣泛的一種標記用酶。HRP的催化底物包括色原底物、化學發(fā)光底物等，其中最常用的色原底物有鄰苯二胺（OPD）、2，2’-吖嗪-（3-乙酰苯基噻唑磺酸-6）（ABTS）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和4-氨基安替比林:苯酚耦聯(lián)底物對等；而化學發(fā)光底物則包括Luminol/增強劑等系統(tǒng)。

應用^[4][5]

用于氨芐青霉素殘留ELISA檢測方法的建立及檢測條件優(yōu)化研究

本研究制備了氨芐青霉素的多克隆抗體，建立了氨芐青霉素免疫檢測技術。通過比較兩種合成方法偶聯(lián)的氨芐青霉素和BSA免疫抗原刺激機體產(chǎn)生抗體的親和性和效價，比較了兩種合成方法的優(yōu)劣。同時，對ELISA檢測條件進行了優(yōu)化，建立氨芐青霉素ELISA檢測技術。

結果如下：1通過兩種方法——物理直接偶聯(lián)和以戊二醛為連接物合成了氨芐青霉素和大分子蛋白質(zhì)的免疫抗原和包被抗原并用紫外光譜掃描和紅外吸收光譜掃描的方法對合成物質(zhì)進行了鑒定。

2將合成的氨芐青霉素免疫抗原與等量佐劑混合后多途徑多次免疫兔子，第七次免疫后心臟采血，分離獲得血清，并將這些血清分成3部分進行處理：一部分直接冷凍于-20℃，一部分與等量甘油混合后保藏于-20℃冰箱，另一部分血清純化分離IgG、冷凍干燥后保存于-20℃冰箱。

3用瓊擴實驗對抗血清進行分析。發(fā)現(xiàn)抗血清能與免疫抗原產(chǎn)生沉淀線，而不能與以OVA作載體蛋白的檢測抗原產(chǎn)生沉淀線。這說明瓊擴實驗是一種很粗略的檢測方法，能檢測出血清中大量存在的載體蛋白抗體，半抗原的抗體因為量少不能在瓊擴實驗中產(chǎn)生沉淀線而被檢測出來。

4對ELISA檢測中所用的HRP酶標山羊抗兔IgG的使用濃度和包被抗原類型及其濃度進行確定。實驗結果表明，酶標二抗的使用濃度是1600倍稀釋。由于HSA和BSA有很大同源性，以其為載體蛋白的合成抗原不能作為檢測抗原。同時，抗血清中存在抗橋抗體，用于檢測的包被抗原和免疫抗原由兩種合成方法含成，以消除抗橋抗體的影響。

56只兔子產(chǎn)生的抗血清的效價分別為：1號抗血清和2號抗血清的效價均是64×103，3號抗血清的效價是1×103，4號抗血清的效價是8×103，5號抗血清的效價是128×103，6號抗血清的效價是4×103。其中1、2、5號兔子產(chǎn)生的抗浙江大學碩士論文血清的效價都遠遠高于3、4、6號兔子產(chǎn)生的抗血清。而1、2、5號兔子都是以Agl作為免疫抗原，3、4、6號兔子的免疫抗原都是Ag4。這說明不同合成方法合成的免疫抗原有不同的免疫原性。‘對間接ELISA檢測條件進行優(yōu)化，包括底物溶液的組成、包被液的選擇、包被時間和溫度的選擇、封閉液的選擇、兔子抗血清的溫育時間、HR衛(wèi)酶標羊抗兔lgG抗體的溫育時間及底物加樣后溫育時間，并用L二（56）正交表對后6個因素進行正交實驗。

加好包被液的酶標板37℃溫育2h后轉入4℃冰箱溫育14h包被。然后以5%甘氨酸封閉醉標板。一抗的溫育時間是1 00min，二抗的溫育時間是120min，加底物顯色1 smin產(chǎn)生的陰陽性抗血清的OD月5。差值。包被液的類型對實驗結果的影響，其次是封閉液的類型和底物作用時間。由于二抗的溫育時間對實驗的結果影響不是很主要，而且二抗溫育40min和溫育1 00min產(chǎn)生的實驗結果相差很少。從節(jié)約時間和成本的角度出發(fā)，在不降低實驗靈敏度的前提下，二抗的握育時間定為40min。

參考文獻

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