進入21世紀，隨著蛋白質組學的研究深入，對多肽合成的要求越來越高。合成肽序越來越長，而且已經不局限于氨基酸的偶聯(lián)，很多都已集中在多肽標記和修飾方法以及蛋白結構與功能模擬多肽的合成或蛋白合成。這就對多肽合成技術提出了更高的要求。
多肽合成技術發(fā)展介紹
多肽化學已經走過一百多年的光輝歷程，1902年，Emil Fischer首先開始關注多肽合成，由于當時多肽合成方面的知識太少，進展也相當緩慢。當時合成采用了苯甲酰，乙酰保護，脫去相當困難，而且容易導致肽鏈斷裂。直到1932年，Max Bergmann等人開始使用芐氧羰基（Z)來保護α-氨基，該保護基可以在催化氫化或氫溴酸的條件下定量脫除，多肽合成才開始有了一定的發(fā)展。到了20世紀50年代，隨著越來越多的生物活性多肽的發(fā)現(xiàn)，大大推動了有機化學合成以及保護基的研究，因此這一階段的研究成果也非常豐富，人們合成了大量生物活性多肽，包括催產素，胰島素等。同時，在多肽合成方法以及氨基酸保護基上面也取得了不少成績，這為后來固相合成方法的出現(xiàn)也提供了實驗和理論基礎。也是在這個階段，F(xiàn)red Sanger發(fā)明了氨基酸序列測定方法，并為此獲得了1958年的Nobel化學獎。后來他還發(fā)明了DNA序列檢測方法，并于1980年再次獲得的Nobel化學獎，成為目前為止唯一兩獲Nobel化學獎的科學家。1963年，Merrifield提出了固相多肽合成方法（SPPS),這個在多肽化學上具有里程碑意義的合成方法，一出來，就由于其合成方便、迅速，現(xiàn)已成為多肽合成的首選方法，而且也帶來有機合成上的一次革命，并成為一支獨立的學科—固相有機合成（SPOS)。當然，Merrifield也因此獲得了1984年的Nobel化學獎。也正是Merrifield的反復篩選，最終摒棄了芐氧羰基（Z)在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基（Boc)用于保護α-氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性條件下定量的脫除，反應也非常迅速，在30min就可以反應完全。由于叔丁氧羰基（Boc)方法中，氨基酸側鏈保護集團大多基于芐基（Bzl)，因此也稱為Boc-Bzl策略。同時，Merrifield在20世紀60年代末發(fā)明了臺全自動多肽合成儀，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124個氨基酸)。隨后的多肽化學研究主要集中于固相合成樹脂，多肽縮合試劑，氨基酸保護基的研究。1972年，Lou Carpino首先將9-芴甲氧羰基（Fmoc)用于保護α-氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應完全。由于其反應條件溫和，迅速得到廣泛使用，到了20世紀80年代取代了叔丁氧羰基（Boc)，成為了固相多肽合成中的首選合成方法。該方法中氨基酸的側鏈大多基于叔丁基（tBu)，因此也成為Fmoc-tBu策略。同時，在多肽合成樹脂，縮合試劑以及氨基酸保護，包括合成環(huán)肽的氨基酸正交保護上也取得了豐碩的成果。
進入21世紀，隨著蛋白質組學的研究深入，對多肽合成的要求越來越高。合成肽序越來越長，而且已經不局限于氨基酸的偶聯(lián)，很多都已集中在多肽標記和修飾方法以及蛋白結構與功能模擬多肽的合成或蛋白合成。這就對多肽合成技術提出了更高的要求。
多肽合成方法的分類
多肽合成方法眾多，但按大類份主要為化學合成和生物合成兩條路徑。
1、化學合成
化學合成主要是通過氨基酸脫水縮合反應來實現(xiàn)。在反應過程中，將原料中不需要參與反應的氨基酸保護基團臨時保護起來，從而實現(xiàn)合成的定向進行。化學合成又分為固相和液相合成，主要區(qū)別在于是否使用固相載體樹脂。
液相合成：液相合成有兩種策略，逐步合成和片段合成。逐步合成簡單迅速，適合大部分多肽合成，而片段合成有利于更大的多肽（含有超過10個氨基酸)?？傮w來說，液相方法由于污染大，反應研發(fā)較為復雜等原因已被固相合成方法所替代。目前，由于其規(guī)模大，單位成本較低等原因仍在10個氨基酸以下的多肽合成中有較廣泛的使用。
圖1.液相合成
固相合成：固相多肽合成的原理是將氨基酸的C末端固定在不溶性樹脂上，然后依次進行縮合反應、延長肽鏈。固相合成法可以細分為Fmoc法和Boc法，。相比之下，F(xiàn)moc方法具有反應條件溫和、反應操作簡單、易于自動化等優(yōu)勢。已成為目前多肽合成的首選。但固相合成仍存在反應效率相對較低、規(guī)?；y度高、成本偏高等問題。
圖2.固相合成
在兩種傳統(tǒng)方法基礎上，多肽合成技術又逐步衍生出羧內酸苷法（NCA)、組合化學法、自然偶聯(lián)法等。
NCA法：氨基酸的羧內酸苷法是一種氨基酸衍生物。NCA法基于陰離子開環(huán)聚合原理，可通過堿類等引發(fā)反應。NCA法反應：在堿性條件下，氨基酸陰離子進攻NCA形成氨基甲酸根離子，酸化時該離子失去二氧化碳形成二肽，該二肽又在堿性條件下形成陰離子進攻其他的NCA，如此反復進行下去。此方法用于多肽的重磅產品格拉替雷的合成。
組合化學法：該方法是在固相多肽合成的基礎上提出來的，即氨基酸的構建單元通過組合的方式連接，合成出含有大量化合物的庫，從中篩選出理化性質或者藥理活性一致的化合物。組合化學法在發(fā)現(xiàn)藥物先導物方面有極大優(yōu)勢。
液相分段合成法：該方法時基于多肽片段能夠在溶液中化學選擇性的自發(fā)連接合成長多肽的特點。常用的連接技術包括天然化學連接（NCL)、光敏感輔助基連接、施陶丁格連接和正交化學連接等。
2、生物合成
生物合成主要包括酶解法、基因工程法、發(fā)酵法和酶催化法。
酶解法：利用生物酶降解大分子動物或植物蛋白，獲得小分子肽。但該方法很難實現(xiàn)工業(yè)化，原因在于產量低、污染加大、產品質量不穩(wěn)定等。
基因工程法：該方法基于DNA重組技術，通過DNA序列來控制多肽序列的生產。該方法的優(yōu)勢是定點性強，生產成本低、安全環(huán)保等。該方法同樣面臨研發(fā)與生產設備投入大、研發(fā)周期長、無法表達非天然氨基酸等缺陷。
發(fā)酵法：發(fā)酵法是利用微生物代謝獲得多肽。特點是成本低，但目前為止，還少有能夠產業(yè)化通過特定微生物發(fā)酵獲得特定多肽的案例。但發(fā)酵方法可以說是生物合成方法的基礎，無論是基因工程法還是合成生物學，在產業(yè)化生產時均有賴于發(fā)酵法的應用。發(fā)酵法未來的應用將非常廣泛。
圖3.發(fā)酵法
酶催化法：酶催化具有活性高、專一性強的特點，十分適合多肽序列的合成。隨著今年來合成生物學技術的發(fā)展，對酶結構改造技術的成熟及構效關系的逐步了解。對于酶的應用也越來越得到重視。目前，已有谷胱甘肽、肌肽等產品能夠應用酶催化方法進行產業(yè)化生產。酶催化反應具有綠色環(huán)保、產業(yè)化成本低廉等優(yōu)勢，但同樣存在研發(fā)難度大、周期長等缺陷。
多肽合成新技術介紹
經過多年發(fā)展，多肽合成的產業(yè)化技術已經逐步成熟。5個氨基酸以下適用于液相合成，5-40個氨基酸選用固相合成更合適，40個氨基酸以上采用生物合成方法更佳已逐步成為一種共識。通過傳統(tǒng)的合成方法，目前已經能夠比較容易的規(guī)?；糠纸Y構較為簡單的多肽產品。但不得不承認，目前的多肽合成方法還遠不能算是完善，每種不同方法均還存在不同程度上的缺陷。本文將著重介紹部分具有產業(yè)化前景的多肽合成新方法。
1、天然化學連接（NCL)
天然化學連接或NCL是化學連接領域的重要擴展，化學連接領域是構建由兩個或多個未保護的肽段組裝而成的大多肽的概念。特別是，NCL是用于合成天然骨架蛋白或中等大小修飾蛋白（即小于200 AA的小蛋白)的最有效的連接方法。天然化學連接使用非保護的多肽片段，不需要酶及化學偶聯(lián)試劑的活化,通常在水溶液中就可完成的多肽合成反應。
1953年，西奧多·威蘭德（Theodor Wieland)和他的同事發(fā)現(xiàn)了纈氨酸-硫酯與半胱氨酸氨基酸在水性緩沖液中的反應可產生二肽纈氨酸-半胱氨酸的化學基礎。反應通過含有半胱氨酸殘基硫的硫酯進行。Wieland的工作導致了一種“活性酯”方法，該方法用于在有機溶劑中的常規(guī)溶液合成中制備受保護的肽段。
在1990年代，Scripps研究所的Stephen Kent及其同事獨立開發(fā)了“天然化學連接”，這是種連接大的未保護肽片段的實用方法。
最早的NCL方法的局限性是它固有地依賴在連接點具有半胱氨酸殘基。半胱氨酸相對不常見，僅占蛋白質所有殘基的1.7％。因此方法的應用受到了極大的限制。隨后，眾多研究者在NCL方法的基礎上進行深入研究，意圖擴展應用領域。這類連接反應一般對原料的N端和C端間的化學結構有特定要求，由特定的N端和C端間的化學選擇性反應得到連接產物。
1.1、通過酯交換反應進行連接
這是由C端為硫酯的多肽片段與N端含有自由巰基或硒基的片段反應，在連接微店形成酰胺鍵，得到與天然多肽和蛋白質一致的骨架。該連接反應至少經過兩個步驟，即硫酯交換捕獲和?；w移反應，在連接位點可以生成的氨基酸殘基。
1.1.1 生成Cys的連接
Kent的小組在1994年首先發(fā)展了連接位點得到Cys的多肽連接方法，他們將方法稱之為“天然化學連接”。它是由C端為硫酯的多肽片段與N端為Cys的片段在pH值7.6的磷酸鹽緩沖液中反應得到的。首先Cys的側鏈巰基與硫酯發(fā)生酯交換反應生成新的硫酯中間體，該中間體迅速通過五元環(huán)過渡態(tài)進行分子內的S→N?；w移反應得到以Cys殘基連接的多肽終產物。這是目前最簡單和實用的多肽片段連接方法。Kent等人利用該方法首先制備了含有72個氨基酸殘基的人白介素L-8蛋白。
圖4.Cys的連接
1.1.2 生成Met的連接
利用N端為高半胱氨酸（Hcy)的多肽和肽硫酯交換，經過六元環(huán)過渡態(tài)S→N?；w移反應后得到位點為Hcy的產物，再用甲基化試劑如對硝基苯磺酸甲酯修飾可以再連接位點生產Met。Tam等利用該方法合成了含有34個殘基的副甲狀腺激素。
1.1.3 生成Gly的連接
Low等人在N端氨基上引入1-氨基-2-巰基結構的輔助基團，進行硫酯交換并發(fā)生S→N?；w移反應后，用酸脫除輔助基團，即可獲得連接位點為Gly殘基的產物。他們用該方法合成了含有106個氨基酸殘基的細胞色素b562。
上述連接反應中，如果原料序列中間包括Cys殘基，其側鏈巰基雖然能夠發(fā)生硫酯交換反應形成硫酯中間體，但這些中間體經逆反應仍可轉化為原料，只有N端Cys/Sec生成的中間體能夠發(fā)生?；嘏欧磻玫椒€(wěn)定的酰胺鍵連接的產物。
1.2 通過亞胺進行連接
這是由肽醛與另一肽段的N端氨基進行連接，這類反應形成的連接點不一定是天然氨基酸殘基。一類反應連接處停止在亞胺結構，如生成肟和腙；另一類由亞胺可以進一步反應得到雜環(huán)，如連接點生成噻唑烷和四氫-β-咔啉環(huán)；還有生成噻唑烷或噁唑烷之后，酰基發(fā)生遷移得到酰胺產物，如生成類脯氨酸的連接。
1.2.1 生成Ser/Thr的連接
香港大學李學臣教授發(fā)展了基于N端絲氨酸/蘇氨酸殘基的新型多肽連接反應（縮寫為STL)。該反應是重要的基于N端非修飾氨基酸殘基且于位點處形成天然肽鍵的多肽連接方法之一。由于自然界中Ser/Thr所占比例遠大于Cys，因此此方法拓展了NCL的應用范圍。其連接反應是利用C端水楊醛酯與N端Ser/Thr發(fā)生偶聯(lián)反應。
圖5.Ser/Thr的連接
1.2.2 生成類脯氨酸的連接
Tam等人發(fā)展類脯氨酸連接反應是由C端肽乙醛酯與N端為Cys、Ser、Thr的肽段相連接。首先乙醛酯與N端氨基形成亞胺，緊接著巰基或羥基對亞胺進行Michael加成得到噻唑烷或噁唑烷，最后?；涍^五元環(huán)過渡態(tài)發(fā)生S/O→N遷移反應生成更為穩(wěn)定的以酰胺鍵存在的硫雜類脯氨酸（SPro)或氧雜類脯氨酸（OPro)產物。在該連接中，側鏈氨基即使生成亞胺，也會發(fā)生逆反應回到原料，因而不參與競爭。
1.2.3 生成噻唑烷的連接
若原料肽醛片段C端為乙醛酯以外的醛時，在N端Cys連接后，因不能經過五元環(huán)過渡態(tài)發(fā)生?；嘏欧磻磻倪B接位點停留在噻唑烷結構。
圖6. 噻唑烷的連接
1.2.4 生成四氫-β-咔啉的連接
Pictet-Spengler 反應是由酸催化的醛酮與色氨酸或色氨縮合生成雜環(huán)四氫-β-咔啉衍生物的反應,被廣泛用于異喹啉及吲哚類似物的合成。Li等人應用該反應, 用肽醛與N端為色氨酸(Trp ) 的多肽片段在冰乙酸中反應24h, 幾乎可以定量地得到長度為17 和18 個殘基的連接產物, 連接位點為四氫-β-咔啉環(huán)，反應中新生成的手性碳原子以兩種構型存在，比例接近1：1。
圖7.四氫-β-咔啉的連接
1.3 通過硫醚和硫酯進行連接
巰基被烷基化生成硫醚的反應可以用來選擇性地修飾蛋白質。以硫醚連接多肽時反應在Cys 側鏈巰基與鹵代物衍生的多肽之間進行, 通?？稍诠滔嗪铣啥嚯牡腘 端偶聯(lián)氯乙酸或溴乙酸得到鹵代多肽, 多肽鏈中所有的巰基均可以反應。生成硫醚的反應速率隨pH 值增加而增加, 但在堿性條件下巰基易氧化形成二硫鍵, 同時鹵代物的水解速度也變快, 因此反應一般在pH7. 5-8.0之間進行, 并加入TCEP 抑制二硫鍵的形成。Robey、Lu及Beekman 等人分別利用生成硫醚的連接方法制備了多肽、多肽樹狀化合物及多肽抗原。
2、特色載體
自固相多肽合成方法發(fā)明后，由于其操作簡便、相對綠色環(huán)保、易于自動化等優(yōu)勢迅速推廣開來，成為目前多肽合成最為主流的方案。但由于固相采用的是不溶性載體，整個反應是非均相反應，其又不可避免的存在反應效率較低，規(guī)?；щy等問題。許多多肽產品采用固相合成方法的單批規(guī)模甚至沒有到達公斤級。因此，許多研究者都在尋找更為合適的特色載體，能夠在保持固相優(yōu)勢的基礎上結合液相的優(yōu)勢。實現(xiàn)更綠色、更簡便、更易規(guī)模化的多肽合成方法。
2.1小分子載體
近日，西北工業(yè)大學欽傳光教授課題組發(fā)展了新型有機磷小分子作為綠色多肽合成載體（GPS)，成功地實現(xiàn)了藥物分子普卡那肽（Plecanatide，商品名稱：Trulance)的液相全合成。該方法采用了無樹脂合成策略來合成長鏈雙環(huán)的普卡那肽，并驗證了通過調控和優(yōu)化DDK衍生物，在有機磷小分子載體上完全可以以無樹脂的方式合成目標產物。值得一提的是，在不需色譜分離的情況下，利用載體輔助沉淀（SAP)技術，省略了多肽合成過程中各中間體純化的手續(xù)，顯著地簡化了繁瑣的多肽合成步驟，提高了反應的可行性和合成效率，很可觀地避免了過量使用溶劑和原材料。
圖8.小分子載體1
圖9.小分子載體2
2.2 聚乙二醇聚合物
Han等用MeO-PEG-OH作為可溶性載體合成了含α-氮雜氨基酸的類肽，總收率達到56.7%。Bayer用PEG10000支載合成了五肽，每一步產率大于99%，無外消旋體產生，光學純度達到100%，反應完成后，可通過沉淀和結晶分離純化產物，簡單、快捷。
2.3 離子液體
離子液體( Ionic Liquids，ILs) 是完全由陰陽離子組成的室溫下為液態(tài)的鹽，陰陽離子可以自由振動、轉動甚至平動，整個有序的晶體結構遭到破壞，導致室溫下呈現(xiàn)液態(tài)。離子液體為綠色溶劑、可循環(huán)使用，具有分子溶劑不可比擬的獨特性能，對大量無機和有機物質包括強極性氨基酸表現(xiàn)出良好的溶解能力，具有溶劑和催化劑的雙重功能，可作為多肽反應介質或活性載體。通過改變陰、陽離子結構組成或對稱性等途徑可以設計不同性質的離子液體，這種可設計性進一步拓寬了其應用范圍。離子液體甚至可以改變反應機理，誘導出新的催化活性，提高反應的轉化率和選擇性。目前，離子液體在多肽化學方面的研究 引起化學家們的廣泛關注。
2.3.1 固相支載型離子液體的肽合成
2017年，Upadhyayula等研究將離子液體嫁接到固體樹脂上，發(fā)展聚苯乙烯樹脂支載型離子液體( PSILs)。為進一步提高聚苯乙烯樹脂負載量，選取了基于二乙醇胺( DEA) 結構功能的離子液體，并采用含 1%二乙烯苯( DVB) 的 PS 樹 脂，提高溶脹性能。通過氯甲基 PS( PS-Cl) 的取代反應，將二乙醇胺引入到PS 樹脂，進一步轉化成相應的功能化固相支載型離子液體。
利用得到PS支載型離子液體，分別合成了二肽( Phe-Leu-OH) 和五肽Leu-enkephalin( Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu) 。收率與純度指標都明顯高于普通固相合成法，二肽產物最高收率98%，五肽產物最高純度 96%。離子液體的兩性特性有利于反應試劑在樹脂表面更好地分散，這對提高反應效率起到至關重要的作用。另外，功能化離子液體的側鏈上設計有多個自由羥基，可以滿足2～3 倍物質的量的氨基酸負載，大幅提高了固相樹脂負載量。此外，離子液體本身所提供的靜電環(huán)境，對增長的肽鏈起到了很好的穩(wěn)定作用，有助于獲得更高產率和更高純度的多肽產物。固相支載型離子液體充分結合了固相合成優(yōu)勢與離子液體功能，成倍增加了負載量，顯著提高了溶脹性能，大幅改善了團聚現(xiàn)象，有效克服固相合成法的缺陷，在產物收率和產品純度方面都明顯優(yōu)于一般固相法，為多肽合成提供了更有效方法。
2.3.2 肽的綠色合成
2013年，Plaquevent等報道了采用離子液體策略合成肽的新方法。該方法巧妙結合離子縮合試劑與離子液體功能，反應中產生的乙基咪唑三氟磺酸鹽副產物為離子液體，充當反應溶劑，除了副產物二氧化碳外，實現(xiàn)了肽合成的零排放。該綠色合成法設計選用1，1-羰基二( 3-乙基咪唑)三氟甲磺酸鹽(CBEIT)作為構建肽鍵的縮合劑，反應過程中釋放產生的乙基咪唑三氟甲磺酸鹽(［H-EIM］［TfO］) 具有較低熔點和合適黏度，是理想的離子液體。該離子液體室溫下具有良好的流動性，因此，合成反應中無需添加任何溶劑，可借此實現(xiàn)無溶劑反應。
圖10. 肽的綠色合成
3、酶催化反應
酶催化合成由于其具有反應條件溫和、選擇性高、綠色環(huán)保等優(yōu)勢被成為新一代的合成技術。目前，酶催化也開始逐步在多肽合成中開始應用，也出現(xiàn)了部分采用全酶催化方法合成的短肽的案例。而隨著酶定向進化技術的發(fā)展，酶催化反應也必然在多肽合成領域有著更廣泛的應用。
3.1、酶催化環(huán)肽的合成
酶催化的環(huán)肽合成是近年來興起的一種新型環(huán)肽合成方法，該法具有反應條件溫和、特異性強、合成效率高等優(yōu)點，另外酶催化的環(huán)肽合成還可以在肽鏈中引入非天然氨基酸或非氨基酸結構，進而大大豐富了環(huán)肽結構。
3.1.1 分選酶Sortase A
分選酶A(Sortase A)是從金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分離出來的一種轉肽酶，能特異地識別肽C端的保守序列LPXTG(Leu-Pro-X-Thr-Gly；X代表任1種氨基酸)，并從蘇氨酸和甘氨酸之間使肽鍵斷裂，形成?；?底物復合物，N端帶有多聚甘氨酸的親核基團進攻復合物，最終形成連接產物。該酶基因工程表達產率較高(232 mg/L)，易于獲取，已廣泛地用于蛋白連接或蛋白標記、細胞表面的蛋白標記和蛋白環(huán)化。
圖11. 分選酶Sortase A
3.1.2 肽連接酶Butelase-1
蝶豆蘭花肽連接酶-1(Bunga telang plus ligase，Butelase-1)是一種天冬酰胺內切蛋白酶(asparaginylendoproteases，AEP)，參與熱帶藥用植物蝶豆中大環(huán)肽合成。2014年由TAM課題組首次從碟豆中分離出來，能識別肽鏈C端三肽序列D/N-HV，并從組氨酸前面進行肽鍵的斷裂，釋放HV二肽序列并形成?；傅孜飶秃衔铮S后的N端氨基酸作為親核基團進攻復合物重新形成肽鍵，產物中連接位點只留下D/N印跡(分選酶A為LPXTG)。蝶豆蘭花肽連接酶-1對底物N端第1，2位氨基酸有一定要求，第1位氨基酸可以為除Pro、Asp和Glu以外的任何天然氨基酸，第2位為疏水性氨基酸Ile、Leu、Val以及Cys。
圖12.肽連接酶Butelase-1
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