背景[1-3]
BL21(DE3)PLYSS感受態(tài)細(xì)胞是采用大腸桿菌BL21（DE3）pLysS菌株經(jīng)特殊工藝處理得到的感受態(tài)細(xì)胞，可用于DNA的化學(xué)轉(zhuǎn)化。使用pUC19質(zhì)粒檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)107，-70℃保存6個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。
基因型：F-,ompT,hsdSB(rB-mB-),dcm,gal(DE3),pLysS,Cmr
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化條件：42℃熱激；誘導(dǎo)方法：IPTG；培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基；生長(zhǎng)條件:
37℃,有氧；抗性:卡那霉素(15 ug/ml),氯霉素（34 ug/ml)。
BL21(DE3)PLYSS感受態(tài)細(xì)胞
菌株特點(diǎn):
BL21 trxB(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞菌株是常用的目的蛋白表達(dá)菌株，該菌株有利于目的蛋白二硫鍵在細(xì)胞質(zhì)中的形成，能有效提高含二硫鍵蛋白的正確折疊和表達(dá)。
BL21trxB宿主菌擁有與AD494菌株相同的硫氧還蛋白還原酶突變體（thioredoxin reductase mutation，TrxB）突變體。該菌株來(lái)源于BL21菌株。由于含有trxB蛋白的宿主菌能夠有效提高細(xì)胞質(zhì)內(nèi)二硫鍵形成，他們能夠提高目的蛋白的正確折疊率。該宿主菌具有卡那霉素抗性，所以這個(gè)菌株只能用于氨芐霉素抗性的質(zhì)粒表達(dá)。
DE3是溶源性的λDE3,所以在lacUV5啟動(dòng)子下攜帶有T7 RNA聚合酶的染色體拷貝。該菌株適用于pET系列載體，及其他T7啟動(dòng)子系列載體。
含有pLSs質(zhì)粒，pLySs質(zhì)粒能夠產(chǎn)生T7溶菌酶，可以有效降低目的基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平。pLySs質(zhì)粒使得該菌株具有氯霉素抗性。pLySs質(zhì)粒的起始復(fù)制位點(diǎn)是p15 Origin,這使得該質(zhì)粒能夠和pUC-及pBR322-衍生的質(zhì)?；ハ喙泊?。
應(yīng)用[4][5]
用于大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化影響因素的研究
用大腸桿菌細(xì)胞制備感受態(tài),然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),已經(jīng)成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中頻繁應(yīng)用的一項(xiàng)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)手段。制備高效而穩(wěn)定的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞是后續(xù)基因克隆、基因表達(dá)工作的重要保障,大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的高低,對(duì)于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成敗也起到非常重要的作用。
大腸桿菌BL21（DE3）常用作外源基因表達(dá)的宿主菌,研究其感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化效率有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。大腸桿菌的制備和轉(zhuǎn)化是一個(gè)復(fù)雜的生物物理和化學(xué)反應(yīng)的過(guò)程。不同基因型的菌種、菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)、感受態(tài)細(xì)胞的制備方法和制備條件、轉(zhuǎn)化過(guò)程的實(shí)驗(yàn)參數(shù)、保存技術(shù)、質(zhì)粒的大小等實(shí)驗(yàn)因素對(duì)轉(zhuǎn)化結(jié)果都能產(chǎn)生影響。
對(duì)大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化的影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究,并優(yōu)化了TSS法,掌握了大腸桿菌BL21（DE3）制備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中需要把控的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)參數(shù)。
通過(guò)本次研究可以得出:（1）保存兩年的大腸桿菌BL21（DE3）甘油菌,在LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng),轉(zhuǎn)接活化兩次,30℃下,培養(yǎng)2-3小時(shí)后的生長(zhǎng)狀態(tài),是制備感受態(tài)的時(shí)期;
（2）大腸桿菌BL21（DE3）的轉(zhuǎn)化時(shí)期出現(xiàn)在OD600=0.4-0.5時(shí),也就是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中前期。此時(shí),大腸桿菌BL21（DE3）的活菌數(shù)目可以達(dá)到1×108個(gè)/m L;當(dāng)OD600=0.46時(shí),用CaCl2方法轉(zhuǎn)化p UC19質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化效率可以達(dá)到4.6×106 cfu/μg質(zhì)粒DNA;
（3）用TSS緩沖液對(duì)OD600=0.46的大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行處理,并制備感受態(tài)細(xì)胞,在轉(zhuǎn)化體系中加入5×KCM（KCl、CaCl2、Mg Cl2的混合溶液）,在復(fù)蘇過(guò)程中加入含有0.2 mol/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基,在一定的轉(zhuǎn)化條件下將質(zhì)粒p UC19轉(zhuǎn)入,其轉(zhuǎn)化效率能夠達(dá)到1.48×107 cfu/μg質(zhì)粒DNA;
（4）用優(yōu)化的TSS法制備感受態(tài)并進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)條件:取培養(yǎng)至OD600=0.46的大腸桿菌BL21（DE3）菌液,在無(wú)菌預(yù)冷離心管中冰浴30min,4℃,4200r/min離心10 min,收集菌體,加入原菌液量1/10的TSS緩沖液,懸浮細(xì)胞并分裝至100 ul,保存至-70℃;轉(zhuǎn)化時(shí)在感受態(tài)細(xì)胞中加入質(zhì)粒5μL,5×KCM 20μL,去離子水75 ul,輕輕混勻,冰浴30 min,室溫放置10 min,加入400μL含0.2 mol/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基,搖床37℃,180 r/min,復(fù)蘇40 min;取200μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板并過(guò)夜培養(yǎng)12-16小時(shí);
（5）用優(yōu)化過(guò)的TSS法制備感受態(tài),轉(zhuǎn)化pUC19質(zhì)粒,得到的轉(zhuǎn)化效率是CaCl2方法的3.2倍。
參考文獻(xiàn)
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