背景[1-3]
人氧化型谷胱甘肽(GSSG)ELISA試劑盒可以定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中GSSG含量。
實驗原理:
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗GSSG抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗GSSG抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的GSSG呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
人氧化型谷胱甘肽(GSSG)ELISA試劑盒
操作步驟:
1.加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100ul（在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。
3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4.每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液）100ul，37℃，60分鐘。
5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
6.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7.依序每孔加終止溶液50ul，終止反應，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進行檢測。
應用[4][5]
用于慢腎康寧對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織的影響及其SIRT1/COX-2表達調(diào)控的實驗研究
觀察慢腎康寧對腺嘌呤誘導的腎間質(zhì)纖維化模型大鼠腎組織的保護作用及其對沉寂信息調(diào)節(jié)因子、環(huán)氧化酶2表達水平的影響，并且在慢性腎衰竭狀態(tài)下衡量大鼠氧化應激的水平，以進一步探討腎間質(zhì)纖維化的作用機制。
方法：Wistar雄性大鼠60只，隨機抽取7只大鼠做為正常組，其余為模型組53只。用腺嘌呤灌胃誘導腎間質(zhì)纖維化大鼠模型。造模成功后，隨機分為5組，分別為模型對照組、氯沙坦組、慢腎康寧高劑量組、慢腎康寧中劑量組、慢腎康寧低劑量組。氯沙坦組予腺嘌呤lOmg.kgid-1*：濃度為0.2%)灌胃；
慢腎康寧高劑量組：予腺嘌呤SO-mg.k-gM-1*：濃度為300%)灌胃1；慢腎康寧中劑量組：予腺嘌呤lS-mg.kgM（濃度為150%）灌胃;慢腎康寧低劑量組:予腺嘌呤T.Smg.kg-M-1（濃度為75%）灌胃。正常組、模型對照組給予等量蒸餾水（0.5ml/100g）灌胃，持續(xù)給藥時間30天。
檢測大鼠血肌酐、尿素氮、24小時尿蛋白量定量、腎小球濾過率水平。并通過常規(guī)制作石蠟切片，行HE染色及Masson染色觀察腎臟組織病理形態(tài)的變化，利用試劑盒檢測腎組織雙氧水含量、氧化型谷胱甘肽及還原型谷胱甘肽，并采用免疫組化和實時熒光定量PCR測定腎組織沉寂信息調(diào)節(jié)因子、環(huán)氧化酶2蛋白及mRNA表達水平。
參考文獻
[1]Cyclo-oxy-genase-2inhibition attenuates the progression of nephropathy in uninephrectomized diabetic rats.KOMERS R,LINDSLEY J,OYAMA T T,et al.Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology.2007
[2]Prevalence of chronic kidney disease in the United States.Coresh J,Selvin E,Stevens LA,et al.The Journal of The American Medical Association.2007
[3]Pathophysiological roles of aldosterone and mineralocorticoid receptor in the kidney.Rafiq K,Hitomi H,Nakano D,Nishiyama A.Journal of Pharmacological Sciences.2011
[4]Aldosterone-induced kidneyinjury is mediated by NF k B activation.FukudaS,Horimai C,Harada K,et al.Clinical and Experimental Nephrology.2011
[5]聶玲輝.慢腎康寧對腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織的影響及其SIRT1/COX-2表達調(diào)控的實驗研究[D].暨南大學,2013.