背景及概述^[1]

 酚試劑是一種常用的測(cè)定蛋白質(zhì)試劑，與蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)包括二步：步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物;第二步是蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑，生成藍(lán)色物質(zhì)。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的量成正比。此法是生化工作領(lǐng)域內(nèi)較廣泛應(yīng)用的一種蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的方法。優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，可測(cè)25～250μg蛋白質(zhì);缺點(diǎn)是該試劑只與蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸起反應(yīng)，因此有蛋白質(zhì)特異性影響，即不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強(qiáng)度稍有不同，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格直線。

應(yīng)用^[2-3]

 應(yīng)用一：

現(xiàn)有的對(duì)空氣中甲醛含量的測(cè)定方法，多利用一些列酶與甲醛發(fā)生的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)處吸光度上升的程度，從而測(cè)算出甲醛的濃度大小。這些方法中所選酶系復(fù)雜，具有一定的檢測(cè)成本，且計(jì)算過程相對(duì)保密，限制了使用范圍。并且其精確度較低，屬于定性測(cè)量，限制測(cè)定的場(chǎng)所。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，利用酚試劑比色法來測(cè)定空氣中甲醛含量，靈敏度高，選擇性好，操作簡(jiǎn)便。

技術(shù)方案為：一種空氣中甲醛含量測(cè)定方法，利用不同濃度的甲醛與酚試劑反應(yīng)生成嗪，采用酚試劑比色法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在硫酸鐵銨的高鐵離子存在下，嗪在酸性溶液中被高鐵離子氧化形成藍(lán)綠色化合物，根據(jù)顏色深淺，比色測(cè)定得出空氣中甲醛含量，具體包括以下步驟：

(1)采樣：采樣前，被采樣房間必須密閉24小時(shí)，采樣需在風(fēng)平浪靜氣候環(huán)境下進(jìn)行，用一個(gè)內(nèi)裝5毫升吸收液的大型氣泡吸收管，以0.5升/分流量，采氣10升；

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取8支10毫升的比色管，按照下表配制標(biāo)準(zhǔn)色列：

在各管中加入0.40毫升1％硫酸鐵銨溶液，搖勻，放置15分鐘后，用1厘米的比色皿，于波長(zhǎng)630納米處，以水為參比，測(cè)定吸光度，以吸光度對(duì)甲醛含量(微克)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線，或用最小二乘法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式：

Y＝bX+a——(a)

(a)式中：

Y—(A-A0)，即標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度(A)與試劑空白液吸光度(A0)之差；

X—甲醛含量，微克；

b—回歸方程式的斜率；

a—回歸方程式的截距，

(3)樣品測(cè)定：采樣后，將樣品溶液移入比色管中，用少量吸收液洗滌吸收管，洗液 并入比色管使總體積為5毫升；

(4)、數(shù)據(jù)處理，按照下式計(jì)算甲醛溶液的濃度C，單位：毫克/毫升，

(b)式中：

A—樣品溶液吸光度；

A0—試劑空白液吸光度；

b—回歸方程式的斜率；

a—回歸方程式的截距；

Vr—換算為參比狀態(tài)下的采樣體積，單位為升。

應(yīng)用二：

目前，檢測(cè)蛋白質(zhì)常用的方法有凱氏定氮法、自動(dòng)定氮儀法、雙縮脈法，通過同時(shí) 對(duì)飼料中的粗蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了分析比較，結(jié)果表明：凱氏定氮法測(cè)定所用的時(shí)間較長(zhǎng)，測(cè)得結(jié)果比較穩(wěn)定；自動(dòng)定氮儀同國(guó)標(biāo)法相比，結(jié)果偏高，相對(duì)偏差較小，但實(shí) 驗(yàn)成本高；雙縮脈法測(cè)定結(jié)果偏低，偏差較大，但操作簡(jiǎn)單，效率高，更適合飼料廠等企業(yè)的快速測(cè)定。因此，這些缺點(diǎn)使得以上方法均無法滿足企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)的需要。酚試劑可用于提供一種牧草飼料中蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

檢測(cè)步驟如下：

（1）稱取牧草飼料粉碎，放入燒瓶中，加入氫氧化鈉溶液，放入60℃的水浴中5h進(jìn)行反 應(yīng)，取出搖勻，加入蒸餾水稀釋40倍，離心5min，靜置；

（2）取上清液放入試管中，加入酚試劑甲液，混合均勻，于38℃恒溫水浴中放置20min；再加入酚試劑乙液，立即振蕩混合均勻，在38℃恒溫水浴中保溫30min，用1cm光徑比色皿在750nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并根據(jù)測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比得到樣品蛋白質(zhì)含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立如下：

（1）試劑配制

標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0.10mg/mL；

酚試劑甲液：將3％碳酸鈉溶液、0.2mol/L氫氧化鈉溶液、0.01％五水硫酸銅溶液、0.02％檸檬酸鉀溶液等體積混合，該溶液當(dāng)天配制當(dāng)天使用；

酚試劑乙液：配制濃度為2.5％的鉬酸鈉溶液，與體積分?jǐn)?shù)為85％的濃磷酸進(jìn)行反應(yīng)，加入硫酸鋰和溴化氫，稀釋5倍，過濾后，保存在棕色瓶中；使用時(shí)前進(jìn)行標(biāo)定；

（2）曲線制作

取8支試管，加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白和蒸餾水混勻后，每管加入4mL酚試劑甲液，混勻，于38℃下放置20min；再加入0.4mL酚試劑乙液，立即振蕩混勻，在38℃下保溫30min，用1cm光徑比色皿在750nm下測(cè)定吸光度；以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

主要參考資料

[1]常用中藥詞語詞典

[2]CN201710579528.2

[3] CN201610949713.1