背景^[1-3]

糖原PAS過碘酸雪夫染色試劑盒即PAS染色試劑盒，也稱糖原PAS染色液試劑盒(Glycogen Periodic Acid-Schiff Staining Kit)，是一種使用過碘酸、雪夫(Schiff)試劑對組織中糖原、粘多糖及真菌等進行染色的試劑盒。本試劑盒適用于不同組織的石蠟切片或冰凍切片、培養(yǎng)的細胞、血涂片、骨髓涂片等樣品。

過碘酸-雪夫染色，即PAS染色，因其主要用于多糖(polysaccharides)如糖原(glycogen)和粘性物質(zhì)(mucosubstances)如黏多糖(glycosaminoglycan)、黏蛋白(mucins)、糖蛋白(glycoproteins)和糖脂(glycolipids)等物質(zhì)的染色，所以也稱糖原染色(Glycogen Staining)。

糖原PAS過碘酸雪夫染色細胞

過碘酸-雪夫染色是病理學(xué)中常規(guī)的染色方法之一，McManus在1946年最先使用過碘酸-雪夫技術(shù)顯示黏蛋白，該染色法不僅能夠顯示糖原還能顯示中性粘液性物質(zhì)和某些酸性物質(zhì)以及軟骨、垂體、真菌、色素、淀粉樣物質(zhì)、基底膜等。另外，臨床診療中PAS染色常用于輔助淋巴細胞性白血病的診斷。

糖原是由D-葡萄糖的分支或直鏈組成的高分子多糖類化合物，糖原的合成與分解代謝主要發(fā)生在肝、腎和肌肉組織中。過碘酸是一種強氧化劑，能將組織或者細胞中的糖原及有關(guān)物質(zhì)中的1,2-乙二醇基(CHOH-CHOH)氧化成兩個游離醛基(-CHO)，且過碘酸的特點是不再繼續(xù)將醛基氧化成羧基。

Schiff試劑(Schiff reagent)，又稱品紅亞硫酸試劑，含堿性品紅和亞硫酸，堿性品紅與亞硫酸結(jié)合后，失去醌式結(jié)構(gòu)而生成無色品紅。無色品紅與過碘酸氧化的游離醛基結(jié)合，醌式結(jié)構(gòu)恢復(fù)，生成洋紅色(magenta)產(chǎn)物，定位于胞漿，顏色深淺與多糖含量成正比。

應(yīng)用^[4][5]

用于磺脲類藥物胰腺外作用研究及機制探討研究

明確大鼠SUR1基因敲除后其糖代謝的改變及特點;探索大鼠SUR1敲除后糖代謝改變的可能機制。

方法1、SUR1敲基因大鼠的構(gòu)建培養(yǎng)及分組在Entrez Gene數(shù)據(jù)庫中查詢SUR1基因ID（25559）。以Sprague-Dawley大鼠為背景,運用TALEN靶向敲除技術(shù)構(gòu)建SUR1敲除大鼠,并運用基因測序及Western blot技術(shù)鑒定SUR1基因成功敲除。分組:4周齡,體重90-140g的大鼠隨機分為:SUS現(xiàn)1-/-雄性大鼠;SUR1-/-雌性大鼠;野生型（wild-type,WT）雄性大鼠;WT雌性大鼠四組,每組6只。標準飼料喂養(yǎng)8周。

2、體重和血糖測定在8周試驗期間,每周測定大鼠體重,并在禁食12小時后采集尾靜脈血測定空腹血糖。

3、葡萄糖耐量（IPGTT）和胰島素耐量（IPITT）測定分別在大鼠4周齡、8周齡和12周齡行IPGTT和IPITT檢測,評估各組大鼠葡萄糖耐量及胰島素抵抗情況。IPGTT:各組大鼠,禁食12小時,給予1克每千克體重的葡萄糖腹腔注射,并分別于注射后的0、15、30、60及120分鐘測尾靜脈血糖并記錄,繪制各組每只大鼠時間-血糖曲線,得到曲線下的面積（areas under curve,AUC）并計算每組AUC均值。IPITT:各組大鼠禁食4小時后給予1個單位每千克體重的胰島素腹腔注射,血糖測定、時間-血糖曲線繪制及平均AUC計算同IPGTT。

4、標本留取:試驗結(jié)束后,將大鼠麻醉,心臟灌注后快速取肝臟、肌肉及胰腺等組織,取材后將組織分為三部分:一部分組織用冷凍切片包埋劑固定;一部分組織固定于4%多聚甲醛中,24小時后脫水并石蠟包埋;其余組織放于液氮快速冰凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。

5、組織病理學(xué)及免疫熒光染色檢測:胰腺:免疫熒光雙染檢測胰腺中胰島素和胰高血糖素的表達。肝臟、肌肉:應(yīng)用過碘酸-雪夫染色（Periodic Acid-Schiff,PAS staining）方法檢測肝臟、肌肉石蠟切片中糖原儲存。肌肉:免疫熒光染色檢測肌肉中葡萄糖轉(zhuǎn)運體4（GLUT4）的表達。

6、蛋白免疫印跡檢測（Western blotting test）將肝臟、肌肉組織從超低溫冰箱取出,裂解液研磨提組織蛋白,應(yīng)用GSK3、p-GSK3、GLUT4等與葡萄糖代謝密切相關(guān)的指標的抗體測定其在每組大鼠肝臟、肌肉中的表達量,以此評估其激活水平的變化。

參考文獻

[1]Disruption of Sur2-containing K（ATP）channels enhances insulin-stimulated glucose uptake in skeletal muscle.Chutkow WA,Samuel V,Hansen PA,et al.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2001

[2]Mechanisms by which glucose can control insulin release independently from its action on adenosine triphosphate-sensitive K+channels in mouse B-cells.Gembal M,Detimary P,Gilon P,Gao ZY,Henquin JC.The Journal of Clinical Investigation.1993

[3]The acute and chronic effects of sulfonylurea therapy in type II diabetic subjects.Kolterman O G,Gray R S,Shapiro G,Scarlett J A,Griffin J,Olefsky J M.Diabetes.1984

[4]Stimulation of glucose uptake and increased plasma membrane content of glucose transporters in L6 skeletal muscle cells by the sulfonylureas gliclazide and glyburide.Tsiani E,Ramlal T,Leiter L A,Klip A,Fantus I G.The Journal of Endocrinology.1995

[5]張瑞.磺脲類藥物胰腺外作用研究及機制探討[D].山東大學(xué),2019.