背景[1-3]
細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)室分析細(xì)胞遷移能力的常用方法。這種方法的原理是，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到融合成單層狀態(tài)時(shí)，在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個(gè)空白區(qū)域，稱為“劃痕”。劃痕邊緣的細(xì)胞會(huì)逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕”愈合。
細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析
實(shí)驗(yàn)步驟：
1.培養(yǎng)板劃線
首先使用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻的劃?rùn)M線，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過(guò)孔。每孔至少穿過(guò)5條線。劃線時(shí)注意線不要太粗。
2.接種細(xì)胞
在孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞（不同的細(xì)胞數(shù)量有所不同，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)快慢調(diào)整），接種原則為過(guò)夜后融合率達(dá)到100%。
3.細(xì)胞劃線
24h后用槍頭或者無(wú)菌牙簽，垂直與細(xì)胞平面，沿著投一天劃在平板背面的線在細(xì)胞層上進(jìn)行劃痕(不同孔之間使用同一只槍頭或牙簽)。
4.清洗細(xì)胞
劃痕完成后，使用無(wú)菌PBS洗細(xì)胞3次，洗去不貼壁的細(xì)胞，即劃線時(shí)劃線的細(xì)胞，是劃線后留下的間隙清晰可見(jiàn)，然后更換新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基。
5.細(xì)胞培養(yǎng)、觀察
將細(xì)胞放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。然后在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)，如0，6，12，24h取出細(xì)胞，顯微鏡線觀察并測(cè)量劃痕的寬度，并拍照(具體時(shí)間依實(shí)驗(yàn)需要而定)。
6.結(jié)果分析
使用Image J軟件打開(kāi)圖片后，隨機(jī)劃取6至8條水平線，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值。
應(yīng)用[4][5]
用于硫酸軟骨素與地塞米松在自動(dòng)化軟骨細(xì)胞劃痕損傷修復(fù)中的作用研究
1、在自動(dòng)平臺(tái)上制造軟骨細(xì)胞劃痕模型。
2、通過(guò)劃痕閉合情況，獲得CS促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)的濃度。
3、研究硫酸軟骨素和地塞米松對(duì)軟骨細(xì)胞損傷修復(fù)的影響。
方法：1、體外提取、培養(yǎng)原代SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)及II膠原免疫熒光染色方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
2、應(yīng)用自動(dòng)平臺(tái)制造軟骨細(xì)胞劃痕模型。
3、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)觀察軟骨細(xì)胞劃痕的閉合過(guò)程。
4、應(yīng)用計(jì)數(shù)有劃痕處固定相等區(qū)域內(nèi)軟骨細(xì)胞數(shù)目，確定促進(jìn)軟骨細(xì)胞愈合的硫酸軟骨素（CS）濃度。
5、應(yīng)用live/dead kit staining方法觀察細(xì)胞存活率。
6、應(yīng)用免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique）檢測(cè)單純劃痕組、CS組、地塞米松組、CS和地塞米松共同作用組對(duì)I型及II型膠原的表達(dá)情況。
結(jié)果：1、應(yīng)用自動(dòng)平臺(tái)制造出8通道的劃痕，劃痕具有水平的起點(diǎn)、止點(diǎn)及相同的寬度。
2、濃度為200μg/ml的CS對(duì)于軟骨細(xì)胞劃痕愈合的促進(jìn)作用。
3、兩種藥物共同作用時(shí)CS可減輕地塞米松對(duì)于軟骨細(xì)胞增殖的抑制作用，I型膠原表達(dá)量較單獨(dú)應(yīng)用地塞米松組減少，II型膠原表達(dá)量則增多。
結(jié)論：1、硫酸軟骨素對(duì)于軟骨細(xì)胞劃痕愈合具有促進(jìn)作用，且在濃度200μg/ml時(shí)作用效果。
2、硫酸軟骨素對(duì)于糖皮質(zhì)激素引起的軟骨損傷具有修復(fù)作用。如臨床應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，可加用硫酸軟骨素保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。
參考文獻(xiàn)
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