背景^[1-3]

BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒是進行蛋白質(zhì)濃度測定的最常用試劑盒。

BCA蛋白定量的主要原理是：蛋白質(zhì)在堿性條件下，可以將二價Cu2+離子還原成一價Cu+離子。產(chǎn)生的一價Cu+離子可以與BCA（Bicinchoninic acid）試劑結(jié)合，最終生成紫色的復(fù)合物。該復(fù)合物在562 nm處有很強的吸收峰。復(fù)合物的多少與蛋白質(zhì)的濃度呈接近的線性關(guān)系。

BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑產(chǎn)品圖

BCA蛋白定量試劑盒有許多優(yōu)點：

1.檢測的靈敏度高，檢測的蛋白質(zhì)濃度下限可達20μg/mL。

2.線性范圍廣，在20-2000μg/mL的范圍內(nèi)，呈接近的線性關(guān)系。

3.兼容性良好，產(chǎn)品可以兼容的化學(xué)物質(zhì)非常廣泛（詳細的兼容情況見附錄）。

產(chǎn)品組成?

1.BCA試劑A:500 mL.

2.BCA試劑B:15 mL.

3.蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA，2 mg/mL）：10 mL.

使用方法

1.BCA工作液的配制

（1）BCA工作液總體積的計算：

BCA工作液總體積=（標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量+待測樣品數(shù)量+1）×重復(fù)數(shù)×200μL。

舉例：如果標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量為8，待測樣品數(shù)量1，重復(fù)數(shù)為3，則BCA工作液總體積=（8+1+1）×3×200μL=6000μL

（2）BCA工作液的配制：按50體積的BCA試劑A中加入1體積的BCA試劑B（A:B=50:1），充分混勻。

舉例：將5000μL的BCA試劑A與100μL的BCA試劑B混合，得到5100μL的BCA工作液。

2.BSA標(biāo)準(zhǔn)品的配制

將BSA標(biāo)準(zhǔn)品做系列稀釋，分別得到如下9個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品：2000μg/mL，1500μg/mL，1000μg/mL，500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.25μg/mL，0μg/mL。

3.取BSA標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品各25μL到96孔板孔內(nèi)，

4.往每孔中加入200μL的BCA工作液，蓋上96孔板蓋子。

5.將96孔板放37℃，30分鐘。

6.用酶標(biāo)儀測562 nm處的光吸收值。

7.根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)品的光吸收值（扣除空白孔的光吸收值即為最終的讀數(shù)），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品的蛋白濃度。

應(yīng)用^[4][5]

用于不同倍性水稻不同發(fā)育時期胚乳蛋白含量測定與谷蛋白質(zhì)譜分析研究

以矮腳南特同源四倍體為材料、相應(yīng)的二倍體為對照,利用BCA蛋白質(zhì)濃度測定法,對稻米胚乳不同發(fā)育時期的4種蛋白（清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白）的積累動態(tài)進行了深入研究,并對谷蛋白進行了質(zhì)譜分析,比較分析同一時期不同材料的谷蛋白及不同時期同一材料的谷蛋白的表達差異。

結(jié)果：同源四倍體水稻的貯藏蛋白各組分分布與其二倍體水稻基本一致。同源四倍體水稻與其二倍體水稻相比,其四種主要貯藏蛋白組分的含量有上調(diào),也有下調(diào)。

開花授粉后第6d,清球蛋白含量同源四倍體水稻高于二倍體水稻,授粉后第7d后清球蛋白含量二倍體高于四倍體,一直到授粉后第20d接近持平;醇溶蛋白含量授粉后第6d到第9d之間基本持平,授粉后第9d二倍體含量高于四倍體;谷蛋白含量從授粉后第6d到第9d處于上升階段,授粉后第9d后含量有所下降,授粉后第12d谷蛋白又有所增加,授粉后第15d含量又下降,授粉后第20d谷蛋白含量明顯比授粉后第15d有所減少。

二倍體與四倍體水稻谷蛋白含量變化趨勢相一致,含量對比,前期二倍體水稻谷蛋白含量比四倍體含量多,后期四倍體水稻谷蛋白含量多。

矮腳南特同源四倍體水稻與二倍體水稻清球蛋白含量從授粉后第6d開始積累且一直呈現(xiàn)上升趨勢,醇溶蛋白含量從授粉后第9d開始積累。谷蛋白含量從授粉后第9d開始下降,接著授粉后第12d又繼續(xù)積累,15d含量到達頂峰,接著又下降一直到授粉后第20d,因此授粉后第9d,12d,15d和20d是谷蛋白含量積累的重要時間點。

參考文獻

[1]Polyploidy and genome evolution in plants[J].Keith L Adams,Jonathan F Wendel.Current Opinion in Plant Biology.2005(2)

[2]Genome evolution in polyploids[J].Jonathan F.Wendel.Plant Molecular Biology.2000(1)

[3]Identification of cis-regulatory elements required for endosperm expression of the rice storage protein glutelin gene GluB-1[J].Haruhiko Washida,Chuan-Yin Wu,Akihiro Suzuki,Utako Yamanouchi,Tomoya Akihama,Kyuya Harada,Fumio Takaiwa.Plant Molecular Biology.1999(1)

[4]Deposition of storage proteins[J].Klaus Müntz.Plant Molecular Biology.1998(1)

[5]冼霖.不同倍性水稻不同發(fā)育時期胚乳蛋白含量測定與谷蛋白質(zhì)譜分析[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué),2018.