背景^[1-3]

RS1細(xì)胞是大鼠皮膚成纖維樣細(xì)胞來源于一大鼠的皮膚組織。成纖維細(xì)胞胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時(shí)呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱之為成纖維細(xì)胞。

體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞多為梭形、多角形和扁平星形等，其形態(tài)尚可依細(xì)胞的功能變化及其附著處的物理性狀不同而發(fā)生改變。電鏡下，其胞質(zhì)可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體。處于成熟期或稱靜止?fàn)顟B(tài)的成纖維細(xì)胞，胞體變小，呈長梭形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體均不發(fā)達(dá)。它具有較強(qiáng)的分裂增殖能力，適應(yīng)性強(qiáng)，是最容易培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞類型之一。

成纖維細(xì)胞是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，細(xì)胞呈梭形或扁的星狀，具有突起。根據(jù)不同的功能活動(dòng)狀態(tài)，將細(xì)胞分為成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞二型。

成纖維細(xì)胞是功能活動(dòng)旺盛的細(xì)胞，細(xì)胞和細(xì)胞核較大，輪廓清楚，核仁大而明顯，細(xì)胞質(zhì)弱嗜堿性，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動(dòng)；處于成熟期或稱靜止?fàn)顟B(tài)的成纖維細(xì)胞，胞體變小，呈長梭形，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體均不發(fā)達(dá)，被稱為纖維細(xì)胞。

纖維細(xì)胞功能活動(dòng)不活躍，細(xì)胞輪廓不明顯，核小著色深，核仁不明顯，細(xì)胞質(zhì)少。在外傷等因素刺激下，部分纖維細(xì)胞可重新轉(zhuǎn)變?yōu)橛字傻某衫w維細(xì)胞，其功能活動(dòng)也得以恢復(fù)，參與組織損傷后的修復(fù)。

應(yīng)用^[4][5]

用于PAI-1-RNAi對(duì)SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響研究

應(yīng)用RNA干擾（RNA Interference,RNAi）技術(shù)下調(diào)纖溶酶原激活抑制劑-1（Plasminogen Activator Inhibitor-1,PAI-1）表達(dá)對(duì)SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞（fibroblast）增殖的影響,通過體外實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平探究PAI-1對(duì)成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化的作用,進(jìn)一步為前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)PAI-1 siRNA可改善SD大鼠瘢痕疙瘩模型提供理論依據(jù),為瘢痕疙瘩（keloid）基因治療開辟新思路。

方法:1 SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)采用組織塊培養(yǎng)法獲取原代SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞,經(jīng)傳代培養(yǎng)去除上皮細(xì)胞、紅細(xì)胞等雜質(zhì)成分,獲取單一成纖維細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長及形態(tài)變化。

2免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定細(xì)胞應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法,通過檢測波形蛋白表達(dá)是否陽性,鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為成纖維細(xì)胞。

3 PAI-1 siRNA轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞,并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組利用脂質(zhì)體（Lipofectamine 2000）轉(zhuǎn)染siRNA至體外培養(yǎng)傳代至第六代的成纖維細(xì)胞,根據(jù)轉(zhuǎn)染不同設(shè)置實(shí)驗(yàn)分組為:轉(zhuǎn)染PAI-1 siRNA的實(shí)驗(yàn)組、轉(zhuǎn)染NC siRNA的陰性對(duì)照組、不進(jìn)行轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組。

4應(yīng)用RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染24小時(shí),PAI-1 m RNA、TGF-β1 m RNA的表達(dá)。

5應(yīng)用Western blot法測定轉(zhuǎn)染48小時(shí),PAI-1、AKT、ERK、p-AKT、p-ERK蛋白的表達(dá)。

6應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞并繪制曲線。分別于轉(zhuǎn)染24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí),制備細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色,鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)以及未被染液染色的細(xì)胞總數(shù)（或被染色的細(xì)胞總數(shù)）,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),細(xì)胞計(jì)數(shù)為縱坐標(biāo),繪制成纖維細(xì)胞生長曲線及成纖維細(xì)胞成活率曲線。

7應(yīng)用CCK-8測定成纖維細(xì)胞的增殖活力繪制曲線。分別于轉(zhuǎn)染24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)加入CCK-8試劑,孵育4小時(shí)后,通過使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度（OD值）,根據(jù)計(jì)算公式,得出細(xì)胞的OD值、細(xì)胞增殖抑制百分率（%）。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),細(xì)胞的OD值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線;以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),細(xì)胞增殖抑制百分率（%）為縱坐標(biāo)繪制增殖抑制率曲線。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料,采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

參考文獻(xiàn)

[1]Clinical Implications of Single-Versus Multiple-Site Keloid Disorder:A Retrospective Study in an Asian Population[J].Tae Hwan Park,Ji Hae Park,Michael H.Tirgan,Ahmad Sukari Halim,Choong Hyun Chang.Annals of Plastic Surgery.2015(2)

[2]Nd:YAG Laser Treatment for Keloids and Hypertrophic Scars:An Analysis of 102 Cases[J].Sachiko Koike,Satoshi Akaishi,Yuki Nagashima,Teruyuki Dohi,Hiko Hyakusoku,Rei Ogawa.Plastic and Reconstructive Surgery Global Open.2014(12)

[3]Keloid incidence in Asian people and its comorbidity with other fibrosis-related diseases:a nationwide population-based study[J].Lei-Ming Sun,Kuo-Hsien Wang,Yuan-Chii G.Lee.Archives of Dermatological Research.2014(9)

[4]Aesthetic earlobe remodeling:my personal experience with an LBO laser at 532 nm[J].Luca Scrimali,Serena Tamburino.Journal of Cosmetic and Laser Therapy.2014(3)

[5]劉樂.PAI-1-RNAi對(duì)SD大鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響[D].河北醫(yī)科大學(xué),2017.