基因敲除

基因敲除（knockout）是指一種遺傳工程技術(shù)，針對(duì)某個(gè)序列已知但功能未知的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被屏蔽，并可進(jìn)一步對(duì)生物體造成影響，進(jìn)而推測(cè)出該基因的生物學(xué)功能。

指外源DNA與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細(xì)胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細(xì)胞的基因組中。此法可產(chǎn)生精確的基因突變，也可正確糾正機(jī)體的基因突變?；蚯度胗址Q基因置換，它是利用內(nèi)源基因序列兩側(cè)或外面的斷裂點(diǎn)，用同源序列的目的基因整個(gè)置換內(nèi)源基因。用于基因敲除和基因嵌入的技術(shù)有Cre/Lox P系統(tǒng)、FLPI系統(tǒng)等。

步驟：

獲得干細(xì)胞

基因敲除一般應(yīng)用于鼠，而最常用的鼠的種系是129及其雜合體，因?yàn)檫@類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。而其他遺傳背景的胚胎干細(xì)胞系逐漸被發(fā)展應(yīng)用，最來(lái)自于C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎干細(xì)胞系成功地用于基因敲除。由于這些遠(yuǎn)交系遺傳背景復(fù)雜，所得到的模式小鼠往往不能得到重復(fù)性好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以也需要在C57BL/6等近交系小鼠上做回交。另一方面，因?yàn)榛亟淮螖?shù)不一樣，也會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差。這對(duì)生物科研，尤其是醫(yī)藥企業(yè)，安評(píng)中心，藥檢部門等，是一個(gè)很大的缺點(diǎn)。這對(duì)開發(fā)制作標(biāo)準(zhǔn)模式動(dòng)物也是一個(gè)很大的缺陷。所以，如果能夠直接用C57BL/6 ES細(xì)胞進(jìn)行基因打靶，就將直接獲得C57BL/6品系的模式小鼠。c57BL/6小鼠種系等已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于免疫學(xué)，神經(jīng)學(xué)，癌癥，等幾乎所有研究領(lǐng)域。已經(jīng)有一些公司或科研機(jī)構(gòu)已經(jīng)開始用C57BL/6遺傳背景的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行基因打靶。

載體構(gòu)建

把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，此重組載體即為打靶載體。因基因打靶的目的不同，此載體有不同的設(shè)計(jì)方法，可分為替換性載體和插入型載體。如為了把某一外源基因引入染色體DNA的某一位點(diǎn)上，這種情況下應(yīng)設(shè)計(jì)的插入型載體要包括外源基因(即目的基因)、同源基因片段及標(biāo)記基因等部分。如為了使某一基因失去其生理功能，這時(shí)所要設(shè)計(jì)的替換型打靶載體，應(yīng)包括含有此靶基因的啟動(dòng)子及外顯子的DNA片段及標(biāo)記基因等諸成分。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌虬休d體分為全基因敲除，條件性基因敲除，基因敲進(jìn)，誘導(dǎo)性基因敲除等打靶載體。

導(dǎo)入基因

將基因打靶載體通過(guò)一定的方式(常用電穿孔法)導(dǎo)入同源的胚胎干細(xì)胞(EScell)中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將打靶載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中從而得以表達(dá)。一般地，顯微注射命中率較高，但技術(shù)難度較大，電穿孔命中率比顯微注射低，但便于使用。

用選擇性培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞

一般地，篩選使用正、負(fù)選擇法，比如用G418篩選所有能表達(dá)neo基因的細(xì)胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表達(dá)的細(xì)胞，剩下的細(xì)胞為命中的細(xì)胞。由于用于TK篩選的Gancyclovir對(duì)小鼠的種系傳遞有影響，一般采用DTA(白喉毒素A亞基）進(jìn)行陰性篩選。將篩選出來(lái)的靶細(xì)胞導(dǎo)入鼠的囊胚中，再將此囊胚植人假孕母鼠體內(nèi)，使其發(fā)育成嵌合體小鼠。

性狀改變

通過(guò)觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進(jìn)而了解目的基因變化前后對(duì)小鼠的生物學(xué)性狀的改變，達(dá)到研究目的基因的目的。

條件性基因敲除法 

條件性基因敲除法可定義為將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。它實(shí)際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，在對(duì)小鼠基因修飾的時(shí)空范圍上設(shè)置一個(gè)可調(diào)控的“按鈕”，從而使對(duì)小鼠基因組的修飾的范圍和時(shí)間處于一種可控狀態(tài)。

條件性敲除的原理: 

利用Cre/LoxP 和來(lái)自酵母的FLP—frt 系統(tǒng)可以研究特定組織器官或特定細(xì)胞中靶基因滅活所導(dǎo)致的表型。通過(guò)常規(guī)基因打靶在基因組的靶位點(diǎn)上裝上兩個(gè)同向排列的1oxP，并以此兩側(cè)裝接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 細(xì)胞產(chǎn)生“loxPfloxed”小鼠,然后，通過(guò)將“loxP floxed”小鼠與Cre 轉(zhuǎn)基因鼠雜交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重組酶)，產(chǎn)生靶基因發(fā)生特定方式(如特定的組織特異性)修飾的條件性突變小鼠。在“loxP floxed”小鼠，雖然靶基因的兩側(cè)已各裝上了一個(gè)loxP，但靶基因并沒(méi)有發(fā)生其他的變化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一樣。但當(dāng)它與Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交時(shí)，產(chǎn)生的子代中將同時(shí)帶有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。Cre 基因表達(dá)產(chǎn)生的Cre 重組酶就會(huì)介導(dǎo)靶基因兩側(cè)的1oxP 間發(fā)生切除反應(yīng)，結(jié)果將一個(gè)loxP 和靶基因切除。這樣，靶基因的修飾(切除)是以Cre 的表達(dá)為前提的。Cre 的表達(dá)特性決定了靶基因的修飾(切除)持性：即Cre 在哪一種組織細(xì)胞中表達(dá)，靶基因的修飾(切除)就發(fā)生在哪種組織細(xì)胞；而Cre 的表達(dá)水平將影響靶基因在此種組織細(xì)胞中進(jìn)行修飾的效率。所以只要控制Cre 的表達(dá)特異性和表達(dá)水平就可實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠中靶基因修飾的特異性和程度。

誘導(dǎo)性基因敲除法 

誘導(dǎo)性基因敲除也是以Cre/loxp 系統(tǒng)為基礎(chǔ)，但卻是利用控制Cre 表達(dá)的啟動(dòng)子的活性或所表達(dá)的Cre 酶活性具有可誘導(dǎo)的特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的控制或利用Cre 基因定位表達(dá)系統(tǒng)中載體的宿主細(xì)胞特異性和將該表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)的過(guò)程在時(shí)間上的可控性，從而在1oxP 動(dòng)物的一定發(fā)育階段和一定組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因進(jìn)行遺傳修飾之目的的基因敲除技術(shù)。人們可以通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的預(yù)先設(shè)計(jì)的方式來(lái)對(duì)動(dòng)物基因突變的時(shí)空特異性進(jìn)行人為控制、以避免出現(xiàn)死胎或動(dòng)物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。常見(jiàn)的幾種誘導(dǎo)性類型如下：四環(huán)素誘導(dǎo)型(圖4)；干擾素誘導(dǎo)型；激素誘導(dǎo)型；腺病毒介導(dǎo)型。

誘導(dǎo)性基因敲除優(yōu)點(diǎn)：

① 誘導(dǎo)基因突變的時(shí)間可人為控制； ② 可避免因基因突變而致死胎的問(wèn)題 ③ 在2 個(gè)loxP 位點(diǎn)之間的重組率較高；  ④如用病毒或配體/DNA 復(fù)合物等基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)來(lái)介導(dǎo)Cre 的表達(dá)，則可省去建立攜帶Cre 的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的過(guò)程。