背景及概述[1]
萊克多巴胺(ractopamine，RAC)是人工合成的β-腎上腺受體激動(dòng)劑，屬于“瘦肉精”的一種，可以同時(shí)提高動(dòng)物的日增質(zhì)量，提高飼料利用率，提高動(dòng)物的蛋白質(zhì)含量。目前只有美國(guó)、加拿大、巴西等24個(gè)美洲和亞太地區(qū)允許將萊克多巴胺用于食用性動(dòng)物(主要用于豬和牛)的促生長(zhǎng)和提高瘦肉率。萊克多巴胺屬于激素類(lèi)添加劑，而激素類(lèi)飼料添加劑用于動(dòng)物后，具有激素殘留的問(wèn)題，對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生副作用，同時(shí)也會(huì)影響消費(fèi)者的健康。歐盟早已明確禁止在食用性動(dòng)物中使用包括萊克多巴胺在內(nèi)的所有β-腎上腺素興奮劑類(lèi)藥物(歐盟96/22/EC法令)，我國(guó)也已經(jīng)于2002年明確將其列入《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄》。中華人民共和國(guó)工業(yè)和信息化部、農(nóng)業(yè)部、商務(wù)部、衛(wèi)生部、國(guó)家工商行政管理總局、國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局聯(lián)合發(fā)布公告，自2011年12月5日起在我國(guó)境內(nèi)禁止生產(chǎn)和銷(xiāo)售萊克多巴胺。近年來(lái)，我國(guó)出入境口岸也屢次在進(jìn)口動(dòng)物性食品中檢出萊克多巴胺。根據(jù)國(guó)家質(zhì)檢總局公布的信息，截至2007年8月底，廣東檢驗(yàn)檢疫局轄區(qū)各口岸已從10批美國(guó)豬產(chǎn)品和一批加拿大豬產(chǎn)品中檢出萊克多巴胺殘留；2008年遼寧大窯灣口岸進(jìn)出境動(dòng)物產(chǎn)品中有4批次97.473噸來(lái)自美國(guó)的凍豬產(chǎn)品被檢出萊克多巴胺；2011年12月由美國(guó)進(jìn)口的近23.5噸凍豬鼻在廣東入境時(shí)被檢出了萊克多巴胺；這些產(chǎn)品均依法全部退運(yùn)出境。因此，出入境口岸對(duì)進(jìn)出口動(dòng)物性食品中萊克多巴胺的檢測(cè)具有十分重要的意義。
制備[2]
β-腎上腺激動(dòng)素萊克多巴胺的合成方法，包括以下步驟：
(1)在500mL三口瓶中加入20g對(duì)羥基苯乙酮、50mL苯和100mL飽和碳酸鈉水溶液，加熱至50℃，緩慢滴加24mL苯甲酰氯，滴加完畢后于40～90℃升溫回流2h，同時(shí)蒸餾出苯；然后慢慢加熱水50mL，繼續(xù)加熱蒸餾至蒸汽溫度90℃，冷卻，有白色晶體析出，抽濾，濾餅用水洗滌至中性，烘干，得酯化物苯甲酸(4-乙酰苯基)酯35.12g。此步收率為99.5％。
(2)將上述酯化物30g、四氯化碳150mL加入500mL三口瓶中，加熱升溫至40℃，緩慢滴加液溴12mL，然后緩慢升溫回流2h，冷卻，得白色結(jié)晶體，抽濾，洗滌，烘干，得溴化物苯甲酸(4-溴乙酰苯基)酯36.24g。此步收率90.6％。
(3)在500mL高壓反應(yīng)釜中，加入覆盆子酮25g、催化劑雷尼鎳2g、溶劑無(wú)水乙醇250mL，密封后，用氫氣置換三次，通入氨氣，保持壓力0.2MPa，常溫下反應(yīng)3h，停止通氨氣，放出余氨；然后通入氫氣，保持氫氣壓力0.5MPa，反應(yīng)10h，過(guò)濾，濾液在蒸餾裝置中蒸餾出溶劑至干，趁熱加入乙酸乙酯于70℃回流1h，冷卻至室溫，抽濾洗滌，濾餅烘干，得到胺化物1-甲基-3-(4-羥基苯基)-丙胺23.64g。此步收率94％。
(4)于500mL三口瓶中，加入上述溴化物30g、胺化物15g，加入乙酸乙酯80mL和飽和碳酸鈉水溶液100mL，常溫下攪拌反應(yīng)3h，抽濾洗滌，得到固體縮合產(chǎn)物苯甲酸[1-甲基-3-(4-羥基苯基)-丙胺基]-乙酰苯酯，不用烘干，直接用于下步反應(yīng)。
(5)將上述固體縮合產(chǎn)物投入500mL三口瓶中，加入200mL含氯化氫20％的鹽酸-甲醇溶液，加熱至60℃保持48h，冷卻，結(jié)晶，抽濾洗滌，經(jīng)烘干，得固體水解產(chǎn)物1-(4-羥基苯基)-2-[1-甲基-3-(4-羥基苯基)-丙胺基]-乙酮22.03g。此步收率90％。
(6)把上述固體水解產(chǎn)物加入500mL反應(yīng)釜中，加入甲醇300mL、鈀碳2g，密封后，用氫氣置換三次，然后加氫至壓力0.45MPa，加熱至40℃，攪拌反應(yīng)20h，冷卻結(jié)晶，抽濾，濾液經(jīng)常壓蒸餾出甲醇，然后減壓真空干燥得粗品，用乙酸乙酯精制，即得白色固體粉末萊克多巴胺(終產(chǎn)物)20.85g，該物質(zhì)的熔點(diǎn)mp為167-168℃。此步收率94％。
檢測(cè)[1]
1 免疫分析方法
免疫分析方法是利用抗原與抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)，主要包括酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫層析法、熒光微球免疫層析技術(shù)和時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)等。
1）酶聯(lián)免疫法
酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是基于競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)反應(yīng)原理，把抗原-抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于萊克多巴胺殘留的檢測(cè)。ELISA法檢測(cè)動(dòng)物性食品中的萊克多巴胺，最低檢測(cè)限可達(dá)0.1ng/mL，平均回收率在70%～90%之間。ELISA 法具有快速、靈敏和高通量等特點(diǎn)，且無(wú)需昂貴的儀器，是目前基層檢測(cè)部門(mén)應(yīng)用的主要方法，一般用來(lái)進(jìn)行大批量樣品的初步篩選，但該方法穩(wěn)定性差，出現(xiàn)的假陽(yáng)性較多，需用氣相質(zhì)譜或液相質(zhì)譜進(jìn)行確證。
2）膠體金免疫層析技術(shù)
膠體金免疫層析技術(shù)(gold immunochromatographyassay，GICA)是近年來(lái)興起的一種快速檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)是一種將膠體金顆粒與包括抗原、抗體在內(nèi)的許多蛋白質(zhì)標(biāo)記形成免疫金復(fù)合物的技術(shù)?；谀z體金免疫層析法研制出的試紙條，可在8～10min內(nèi)完成萊克多巴胺測(cè)試，檢測(cè)限為5ng/mL，肉眼即可判斷[10]。膠體金免疫層析技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、特異、靈敏的特點(diǎn)，不需要借助相關(guān)儀器，檢測(cè)效率能得到很大提高，適合大規(guī)模樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
3）熒光微球免疫層析技術(shù)
熒光微球免疫層析方法比膠體金免疫層析方法具有更高的靈敏度。劉道峰等[11]以熒光微球?yàn)樾滦蜆?biāo)記物，采用EDC法進(jìn)行偶聯(lián)，制備了萊克多巴胺抗體熒光微球復(fù)合物，并以之為探針對(duì)萊克多巴胺進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為2.5ng/mL，且特異性強(qiáng)、檢測(cè)范圍寬。
4）時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)
時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。TRFIA作為一項(xiàng)新興的超微量標(biāo)記免疫技術(shù)，其靈敏度比ELISA法更高、穩(wěn)定性更好，目前已有其應(yīng)用于萊克多巴胺檢測(cè)的報(bào)道。
2.色譜分析技術(shù)
色譜分析技術(shù)是萊克多巴胺檢測(cè)中常用的定量和確證方法，主要包括高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜法(HPLCMS)等。
1）高效液相色譜法
萊克多巴胺的HPLC法檢測(cè)主要是采用SPE固相萃取小柱凈化，二極管陣列檢測(cè)器(diode array detector，DAD或熒光檢測(cè)器(fluorescence detector，F(xiàn)LD)檢測(cè)。由于萊克多巴胺的紫外吸收波長(zhǎng)在224nm左右，采用HPLC-DAD對(duì)萊克多巴胺進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，在此波長(zhǎng)附近干擾較大，通常不采用DAD檢測(cè)器檢測(cè)。萊克多巴胺含酚羥基，具有熒光性，可采用FLD檢測(cè)器測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)約為226nm，發(fā)射波長(zhǎng)約為305nm，該方法靈敏，檢出限可達(dá)0.3μg/L，同時(shí)可排除雜質(zhì)干擾。
2）氣相色譜-質(zhì)譜法
萊克多巴胺化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有不易氣化的羥基和氨基，屬于高沸點(diǎn)、難揮發(fā)的化合物，衍生后才能測(cè)定。常用的衍生劑有BSTFA(雙三甲基硅烷基三氟乙酰胺)和BSTFA+1%TMCS(三甲基氯硅烷)，衍生溫度為80℃左右，衍生時(shí)間為1h。采用GC-MS對(duì)豬肝臟中萊克多巴胺檢測(cè)的檢出限和定量限分別為0.5ng/g和2.0ng/g，對(duì)豬尿的檢出限和定量限分別為0.3μg/L和1.0μg/L。GC-MS是萊克多巴胺檢測(cè)最常用的定量和確證方法，但是它需要衍生，衍生效率對(duì)測(cè)定結(jié)果影響很大，因此加標(biāo)回收率不高，同時(shí)衍生劑和甲苯有極強(qiáng)的毒性。
3）液相色譜-質(zhì)譜法
液相色譜-質(zhì)譜法不需要衍生，采用內(nèi)標(biāo)法定量，在提高效率的同時(shí)提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，采用UPLC-ESIMS-MS對(duì)牛肉中的萊克多巴胺的檢出限和定量限分別為0.07μg/kg和0.22μg/kg。液相質(zhì)譜法靈敏度高，重現(xiàn)性強(qiáng)，適用于萊克多巴胺的確證檢測(cè)，但是其分析成本昂貴，難以普及。
3. 傳感器技術(shù)
1）生物傳感器技術(shù)
近年來(lái)，表面等離子體共振(SPR)生物傳感器受到人們的關(guān)注，原理為將能夠與待測(cè)物結(jié)合的物質(zhì)固定在傳感器芯片上，當(dāng)待測(cè)物流過(guò)芯片表面時(shí)與芯片表面的物質(zhì)結(jié)合，引起芯片表面光學(xué)參數(shù)變化，并以電信號(hào)的形式表現(xiàn)出來(lái)。該技術(shù)可在15min內(nèi)完成單個(gè)樣品的萊克多巴胺檢測(cè)，檢出限達(dá)0.6μg/kg。
該技術(shù)無(wú)需對(duì)分子進(jìn)行標(biāo)記，方法的建立和樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，所需樣品量少，可利用動(dòng)力學(xué)特性繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)時(shí)間短，可分析弱相互作用或瞬間相互作用，可實(shí)時(shí)檢測(cè)。
2）電化學(xué)傳感器技術(shù)
采用Nafion-Au-Nafi on修飾玻碳電極，建立了萊克多巴胺的循環(huán)伏安電化學(xué)傳感方法，在pH2.0、B-R為支持液、富積時(shí)間120s、掃描速度50mV/s、電位1.1V條件下，檢測(cè)限可達(dá)2μg/L，檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)5min。
4. 分子印跡技術(shù)
分子印跡技術(shù)的原理是：當(dāng)模板分子(印跡分子)與聚合物單體接觸時(shí)會(huì)形成多重作用點(diǎn)，通過(guò)聚合過(guò)程這種作用就會(huì)被記憶下來(lái)，當(dāng)模板分子除去后，聚合物中就形成了與模板分子空間構(gòu)型相匹配的具有多重作用點(diǎn)的空穴，這樣的空穴將對(duì)模板分子及其類(lèi)似物具有選擇識(shí)別特性。分子印跡技術(shù)具有預(yù)定性、識(shí)別性和實(shí)用性等特點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于色譜技術(shù)(固相萃取前處理)、酶聯(lián)免疫技術(shù)、電化學(xué)傳感器技術(shù)中，對(duì)動(dòng)物性食品中的萊克多巴胺進(jìn)行檢測(cè)。
5. 光譜技術(shù)
近年來(lái)，光譜技術(shù)用于鹽酸萊克多巴胺的檢測(cè)也有了新的進(jìn)展，主要是表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)和太赫茲時(shí)域光譜。將表面增強(qiáng)拉曼散射光譜(SERS)用于豬尿中萊克多巴胺的檢測(cè)，樣品中的萊克多巴胺采用液液萃取LLE)和液液萃取-固相萃取(LLE-SPE)兩種方式提取后分別進(jìn)行SERS檢測(cè)，檢測(cè)限分別為0.8μg/mL和0.4μg/mL。SERS技術(shù)測(cè)量樣品的制備方法簡(jiǎn)單，具有很大的潛力，可用于快速分析的豬尿中萊克多巴胺。
6.化學(xué)發(fā)光法
根據(jù)堿性介質(zhì)中萊克多巴胺對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀體系化學(xué)發(fā)光的增敏作用，建立了新的流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光快速測(cè)定萊克多巴胺的方法，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度與萊克多巴胺質(zhì)量濃度在0.004～0.8μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為2.5μg/kg。
參考文獻(xiàn)
[1]石晶,王毅謙,吳福平,郭旸.動(dòng)物性食品中萊克多巴胺檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].肉類(lèi)研究,2013,27(04):44-47.
[2] CN201110004968.8 β-腎上腺激動(dòng)素萊克多巴胺的合成方法