背景^[1-3]

Imprint Ultra Chromatin Optimization Kit（染色質(zhì)免疫共沉淀優(yōu)化試劑盒）是一組完整的優(yōu)化的試劑，可以用來對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織進(jìn)行高通量染色質(zhì)免疫共沉淀；此高特異性和靈敏度的試劑盒適合用來富集特異性的染色質(zhì)片斷。優(yōu)化的方案和組分使得非特異性背景降低并提高目的蛋白-DNA復(fù)合物的收集量。通過此試劑盒收集的DNA可以用于各種小有實(shí)驗(yàn)，如PCR（ChIP-PCR），microarrays（ChIP-on-chip），和sequencing（ChIP-seq）。

蛋白質(zhì)-DNA相互作用在細(xì)胞功能方面起到了重要作用，比如信號(hào)傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)降解，DNA復(fù)制和重組，表觀沉默等辨別DNA結(jié)合蛋白的靶標(biāo)以及了解蛋白質(zhì)-DNA相互作用對(duì)于研究細(xì)胞各項(xiàng)過程有著重要的作用。染色質(zhì)免疫共沉淀提供了一個(gè)研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的強(qiáng)有力的工具。它可以通過PCR（ChIP-PCR），microarrays（ChIP-chip），or sequencing（ChIP-seq）檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)結(jié)合在特定序列上的蛋白.比如，通過ChIP-PCR檢測(cè)特定基因啟動(dòng)子區(qū)域不同條件下組蛋白H3-k9甲基化（meH3-K9）的程度.而在基因組范圍內(nèi)啟動(dòng)子區(qū)域富集的甲基化H3-K9可以用ChIP-on-chip或是ChIP-sequencing測(cè)定.ChIP分析要求參與實(shí)驗(yàn)的DNA含有的背景很低，這樣才能識(shí)別真正的轉(zhuǎn)錄因子富集區(qū)域.在ChIP實(shí)驗(yàn)中的高背景主要是未洗充分導(dǎo)致，或者是交聯(lián)逆轉(zhuǎn)不夠充分，DNA片段長(zhǎng)度不適合，或是RNA片段的干擾.為了有效地捕獲轉(zhuǎn)錄因子-DNA復(fù)合物（通常含量很低），就需要高質(zhì)量的ChIP方案。

特點(diǎn)：1.高效率陽(yáng)性DNA和陰性對(duì)照產(chǎn)物之比大于500，每次反應(yīng)只需2000個(gè)細(xì)胞2.優(yōu)化的緩沖液和方案使得ChIP背景極低，提高了反應(yīng)的靈敏度和特異性3.抗體效率高，采用了化結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量的融合型抗體4.反應(yīng)時(shí)間短，只需5h 5.靈活便捷，可以進(jìn)行單個(gè)樣品實(shí)驗(yàn)，也可以高通量實(shí)驗(yàn)6.產(chǎn)物可以進(jìn)行多種下游實(shí)驗(yàn)，如ChIP-PCR，ChIP-on-chip，和ChIP-seq。

應(yīng)用^[4][5]

用于p53及其異構(gòu)體113p53/133p53的功能機(jī)制研究和體外染色體免疫共沉淀技術(shù)的構(gòu)建

p53可被多種脅迫信號(hào)激活,決定細(xì)胞的生與死,但p53蛋白到底如何精確調(diào)控紛繁復(fù)雜的下游信號(hào)通路,至今仍是一個(gè)未被完全解開的謎題。近年來發(fā)現(xiàn)p53存在眾多異構(gòu)體,對(duì)這些異構(gòu)體蛋白功能的研究將有助于揭示p53信號(hào)途徑調(diào)控的謎團(tuán)。113p53(斑馬魚)/133p53(人)是N-端缺失的p53異構(gòu)體,已有研究證明113p53/133p53具有拮抗p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡功能。

結(jié)果如下：

1)采用斑馬魚p53抗體Zfp53-N(只能識(shí)別全長(zhǎng)p53)進(jìn)行免疫共沉淀,利用另一個(gè)斑馬魚p53抗體Zfp53-A7C10(可識(shí)別全長(zhǎng)p53和113p53蛋白)檢測(cè)沉淀蛋白,首次證實(shí)了內(nèi)源性p53與113p53可在DNA損傷條件下互作形成蛋白復(fù)合物。進(jìn)一步構(gòu)建113p53蛋白寡聚結(jié)構(gòu)域的單氨基酸突變體,找到兩個(gè)喪失與p53蛋白結(jié)合能力的113p53突變體。利用這兩個(gè)突變蛋白,揭示了113p53與p53的蛋白互作對(duì)于113p53拮抗p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡功能是必不可少的。

2)通過在人的細(xì)胞系中過表達(dá)p53、133p53或兩者共同過表達(dá),利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)代謝相關(guān)基因表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)133p53能夠抑制p53對(duì)Gls2、TIGAR和Sestrinl的轉(zhuǎn)錄激活作用,特別是谷氨酰胺酶Gls2基因,被顯著下調(diào)一半。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示133p53可能在抑制有氧代謝、促進(jìn)糖酵解、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等信號(hào)途徑中扮演重要角色。

3)發(fā)現(xiàn)△113p53蛋白在野生型斑馬魚胚胎中能被γ-射線照射而非紫外線照射或熱激誘導(dǎo)大量表達(dá),深入研究表明113p53可以通過直接結(jié)合到DNA雙鏈損傷(DSB)修復(fù)相關(guān)基因如rad51、rad52和ligase4啟動(dòng)子中一些新型的反應(yīng)元件,來促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)錄表達(dá),首次證明了113p53可獨(dú)立于p53而發(fā)揮調(diào)控功能。

參考文獻(xiàn)

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