背景[1-4]
MAXUPMRNA建庫試劑盒是針對Illumina高通量測序平臺專門研發(fā)的用于mRNA轉錄組文庫構建試劑盒MaxUp mRNA建庫試劑盒cDNA二鏈合成模塊配有兩種buffer，可根據(jù)需要進行常規(guī)建庫或鏈特異性建庫。適用于起始模板為10 ng-1μg不同來源真核生物總RNA樣本。經(jīng)過mRNA分離、片段化、鏈雙鏈cDNA合成、末端修復、加A尾、接頭連接和文庫擴增，總RNA樣品zui終轉化為適用于Illumina平臺測序的文庫。
試劑盒包含三個獨立模塊，BOX-I的核心為純化mRNA所需的poly（A）磁珠。BOX-II包含mRNA片段化試劑，反轉錄試劑，常規(guī)和鏈特異性dscDNA合成所需的所有試劑。其中鏈特異性二鏈合成buffer中將dTTP替換為dUTP，使cDNA第二鏈中摻入dUTP，而本試劑盒使用的高保真DNA聚合酶無法擴增含尿嘧啶的DNA模板，實現(xiàn)鏈特異性。
MaxUp mRNA建庫試劑盒適用于起始模板量為10-1000 ng（體積≤50μL）的高質量動物、植物和真菌等真核生物的總RNA。如初始RNA濃度偏低，體積超過50μL，可使用Hieff NGSTM RNA Cleaner磁珠進行濃縮。RNA需通過Agilent 2100 Boanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片檢測，RIN值要求＞7，以保證mRNA有完整的poly(A)尾結構。MAXUPMRNA建庫試劑盒的mRNA分離模塊使用的是oligo d(T)磁珠，只有帶poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的mRNA，如非編碼RNA、無poly(A)尾的mRNA等不能適用本試劑盒。此外，F(xiàn)FPE樣本中的mRNA降解嚴重，通常無完整的poly(A)尾結構，故亦無法使用本試劑盒進行建庫。
MAXUPMRNA建庫試劑盒所制備文庫可進行多種RNA-Seq應用，包括：
基因表達（gene expression）
單核苷酸變異檢測（single nucleotide variation discovery）
基因融合鑒定（gene fusion identification）
剪切變異體分析（splice variant analysis）
應用[5][6]
用于基于高通量Illumina測序技術的干旱脅迫下大豆根和葉mRNA表達譜研究農作物必須適應各種極端脅迫環(huán)境。大豆是一種重要的經(jīng)濟作物,其產量明顯的受干旱脅迫影響,因此培育與耐旱相關的作物已成為當務之急。雖然目前在研究耐旱機理方面取得了一定的進展,但是耐旱的分子機制仍然不十分清楚。為了更好的理解大豆響應干旱脅迫的分子機制,同時克隆大豆中與干旱密切相關的干旱應答基因,研究旱堿1號大豆幼苗在干旱脅迫(含有2% PEG 8000的Hoagland培養(yǎng)液)下48小時根和葉的轉錄表達譜?；谇捌诘囊恍嶒?我們通過高通量Illumina測序研究基因在轉錄水平的表達,同時應用生物信息學軟件對測序結果進行分析。結果如下：
1.干旱脅迫下根和葉中分別有2956個和1620個差異表達基因。其中,根特異性差異基因2383個,葉特異性差異基因1047個,根葉共表達差異基因573個。
2.BGI WEGO軟件對差異表達基因進行了主要生物學功能分類。干旱脅迫下所有差異表達基因中,描述基因細胞組件的有11類,描述基因分子功能的有12類,描述基因參與的生物過程的有16類。
3.通過cluster和javaTreeview軟件,對根葉共表達差異基因進行了聚類分析,在逆境條件下表達相似的基因成簇的聚到一起。
4.通過對干旱脅迫應答基因的研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下與核苷酸途徑相關的一些順式作用元件和反式作用因子基因表達上調,進一步對這些基因在分子水平上進行分析,表明這些基因處在ABA依賴和ABA非依賴兩大調控網(wǎng)絡中,同時這些pathway彼此之間相互聯(lián)系。
5.應用Real-time RT-PCR方法驗證分析了Illumina測序出的6個基因,結果表明這6個基因在干旱脅迫下表達量改變倍數(shù)和表達譜測序中獲得的差異表達倍數(shù)基本一致,從而表明測序數(shù)據(jù)真實可靠。
參考文獻
[1]Intronic Alternative Splicing Regulators Identified by Comparative Genomics in Nematodes[J].Jennifer L Kabat,Sergio Barberan-Soler,Paul McKenna,Hiram Clawson,Tracy Farrer,Alan M Zahler.PLOS Computational Biology.2006(7)
[2]Sequence analysis of mRNA polyadenylation signals of rice genes[J].Ying Lu,Chenxi Gao,Bin Han.Chinese Science Bulletin.2006(9)
[3]Cloning and sequence analysis of a low temperature-induced gene from trifoliate orange with unusual pre-mRNA processing[J].Y.Jia,H.S.Rio,A.L.Robbins,E.S.Louzada.Plant Cell Reports.2004(3)
[4]Characterization of the genes for two soybean aspartic proteinases and analysis of their different tissue-dependent expression[J].Kaede Terauchi,Tomiko Asakura,Naoko K.Nishizawa,Ichiro Matsumoto,Keiko Abe.Planta.2004(6)
[5]MECHANISMS OF ALTERNATIVE PRE-MESSENGER RNA SPLICING[J].Douglas L.Black.Annual Review of Biochemistry.2003
[6]范秀朵. 基于高通量Illumina測序技術的干旱脅迫下大豆根和葉mRNA表達譜研究[D].吉林農業(yè)大學,2011.