背景及概述[1-2]

胰蛋白酶抑制劑是抑制胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶抑制劑，可能是外源性或內(nèi)源性化合物。包括：α-抗胰蛋白酶、抑蛋白酶多肽、卵黏蛋白、BowmarrBirk大豆胰蛋白酶抑制物、Kazal胰腺胰蛋白酶抑制物、Kunitz大豆胰蛋白酶抑制物等。胰蛋白酶(Trypsin)在脊椎動(dòng)物中，作為消化酶而起作用。其在胰臟以酶的前體——胰蛋白酶原被合成的。胰蛋白酶原受腸激酶或胰蛋白酶的限制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷。其不僅起消化酶的作用，而且能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前體，起活化作用。胰蛋白酶抑制劑(Trypsininhibitor，TI)普遍存在于自然界的動(dòng)物、植物和微生物中，目前，研究較多的胰蛋白酶抑制劑主要來源于人類主要的糧食，如豆科、喬本科，在十字花科中也有報(bào)道。而在動(dòng)物界中，動(dòng)物的血液、胰臟，以及酵母菌、鏈霉菌屬等微生物中亦有胰蛋白酶抑制劑的存在。

分類及結(jié)構(gòu)[2]

胰蛋白酶抑制劑可以與胰腺分泌的絲氨酸蛋白酶系(如胰蛋白酶、糜蛋白酶等)發(fā)生不可逆的反應(yīng)。胰蛋白酶抑制劑與其靶酶的相互作用，通常與酶和底物之間的相互作用一樣，屬于互補(bǔ)型作用機(jī)制。胰蛋白酶抑制劑與胰蛋白酶(或糜蛋白酶)相互反應(yīng)時(shí)，抑制劑暴露在外的活性中心(反應(yīng)位點(diǎn))與靶酶的活性中心通過氫鍵相連，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而導(dǎo)致酶活性中心的閉鎖，使靶酶的活性喪失，且此反應(yīng)是不可逆的。與通常的酶催化反應(yīng)相比，胰蛋白酶與其抑制劑之間反應(yīng)的米氏常數(shù)(Km)很低，故胰蛋白酶與其抑制劑的親和力大，兩者可以迅速結(jié)合成無活性、不可逆的復(fù)合物。與一般的酶的底物不同，酶對(duì)抑制劑的反應(yīng)位點(diǎn)的肽鍵并不能作用，抑制劑與酶結(jié)合后其活性中心的肽鍵并不裂解或裂解速率極慢。因此，該復(fù)合物雖然可以分解成游離的酶和變性或未變性的抑制劑，但解離速率非常緩慢。

結(jié)構(gòu)[2]

胰蛋白酶抑制劑根據(jù)分子質(zhì)量、半胱氨酸含量、反應(yīng)位點(diǎn)的數(shù)量主要可分為Kunitz型抑制劑、Bowman-Birk型抑制劑、PotatoⅠ型、PotatoⅡ型及Kazal型。其中研究最為廣泛和深入的是Kunitz型抑制劑及Bowman-Birk型抑制劑兩類，分別是庫尼茲胰蛋白抑制劑(KunitztypeTrypsininhibitor，簡稱KTI)和鮑曼-貝爾克胰蛋白酶抑制劑(Bowman-BirktypeTrypsininhibitor，簡稱BBTI)。1947年首次自大豆中分離和結(jié)晶出Kunitz胰蛋白酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)其分子質(zhì)量約20.1kD，其半胱氨酸含量相對(duì)低，分子內(nèi)含有2個(gè)二硫鍵和1個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)，該反應(yīng)位點(diǎn)一般只能與胰蛋白酶相互作用。大豆中的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑，分子內(nèi)含有181個(gè)氨基酸殘基，2個(gè)二硫鍵(Cys39～Cys86、Cys138～Cys145)，分子中多以松散的線團(tuán)狀的分子存在，位于138位和145位的半胱氨酸之間形成了二硫鍵，結(jié)合形成了一個(gè)由8氨

基酸組成的小環(huán)，另外在39位和86位的半胱氨酸之間形成了第2個(gè)二硫鍵。其活性中心位于第63位的精氨酸和第64位的異亮氨酸，這2個(gè)氨基酸位于分子的外部，并且一個(gè)KTI分子抑制劑能鈍化1個(gè)分子胰蛋白酶。其他來源的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑也被陸續(xù)研究。而來自牛的胰腺的胰蛋白酶抑制劑也屬于Kunitz型，其分子質(zhì)量為6.5kD，含有3個(gè)二硫鍵，但同樣只有1個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)。利用晶體學(xué)和圓二色性方法研究大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的蛋白結(jié)構(gòu)主要由β折疊組成，同時(shí)由12組反向平行的β-股以疏水側(cè)鏈、隨機(jī)卷曲和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)穩(wěn)定形成的十字交叉的區(qū)域。Kunitz型胰蛋白酶抑制劑已經(jīng)從刺桐(Erythrina)、四棱豆、牧豆樹、葵花籽、洋紫荊(Bauhinavariegata)、鳳凰木(Delonixregia)、豬屎豆(Crotalariapaulina)、黎豆(Mucunapruriens)、海紅豆(Adenantherapavonina)、棕色腰豆等植物的種子及土豆等提取獲得。Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑(BBTI)于1946年由自大豆中分離獲得。該Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑的分子質(zhì)量大約為8kD，富含半胱氨酸，包含2個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)及7個(gè)二硫鍵。2個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)分別抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，反應(yīng)位點(diǎn)的單邊結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。一環(huán)狀結(jié)構(gòu)為胰蛋白酶結(jié)合區(qū)域含有4個(gè)二硫鍵，可抑制胰蛋白酶的活性，而另一環(huán)狀結(jié)構(gòu)為胰凝乳蛋白酶的結(jié)合區(qū)，存在3個(gè)二硫鍵，可與胰凝乳蛋白酶相結(jié)合抑制其活性。由于分子內(nèi)富含二硫鍵和亞基間的極性相互作用，這些BBTI的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性較好。目前已從多種來源中分離純化得到BBTI。自中國竹臭蛙的皮膚分泌物中提取獲得只有62個(gè)氨基酸的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑。自蠶豆中，利用色譜法分離了分子質(zhì)量為7.5kD的Bowman-Birk型抑制劑，其具有抗菌作用，可抑制HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶活性，同時(shí)對(duì)鼠的脾細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用。

PI-Ⅰ和PI-Ⅱ家族是一類誘導(dǎo)型的蛋白酶抑制劑。其中PI-Ⅰ家族包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅰ和番茄蛋白酶抑制劑Ⅰ，它們的分子質(zhì)量為8.1kD，只有1個(gè)活性中心，主要抑制胰蛋白酶，而對(duì)胰凝乳蛋白酶抑制作用較弱。PI-Ⅱ家族包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅱ和番茄蛋白酶抑制劑Ⅱ，由2個(gè)重復(fù)序列構(gòu)成，分子質(zhì)量為24kD，包含2個(gè)活性中心，能抑制胰蛋白酶和凝乳蛋白酶。 

生物功能[2]

胰蛋白酶抑制可以與生物的胰蛋白酶結(jié)合，不可逆形成無酶活性的復(fù)合物，從而抑制了生物對(duì)蛋白質(zhì)的消化、吸收和利用等能力，也因此被稱為抗?fàn)I養(yǎng)因子。而昆蟲攝入蛋白酶抑制劑后，其與昆蟲腸道的蛋白酶形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而使昆蟲的蛋白消化酶活性受到抑制。同時(shí)，蛋白酶和蛋白酶抑制劑的復(fù)合物還可能作為一個(gè)負(fù)反饋信號(hào)抑制昆蟲的進(jìn)食。這種重效應(yīng)將降低害蟲對(duì)食物蛋白的有效利用率同時(shí)也減少了食物的攝取，最終導(dǎo)致昆蟲由于缺乏必需的營養(yǎng)(蛋白質(zhì))停止發(fā)育并最終死亡?？瓜x害是胰蛋白酶抑制劑的生物功能。胰蛋白酶抑制劑的生理作用除了抗微生物、抗蟲害外，其對(duì)生物的生長發(fā)育，甚至細(xì)胞的凋亡也都有調(diào)節(jié)作用。而近些年來人們也注意到了胰蛋白酶抑制劑的抗病毒和抗癌作用，并廣泛開展了這方面的相關(guān)研究。在抗病毒方面，豆類中提取了Kunitz型胰蛋白酶抑制劑，該抑制劑可以抑制對(duì)HIV-1增殖至關(guān)重要的HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶的活性，從而使得此胰蛋白酶抑制劑具有了抑制HIV-1增殖的可能性。Ye等[18]發(fā)現(xiàn)來自蠶豆的Bowman-Birk型抑制劑也同樣具有抑制HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶活性的作用。這些研究都說明胰蛋白酶抑制及具有抑制病毒增殖的可能性。

在抗腫瘤方面，自北海道黑豆中提取的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑顯示了對(duì)MCF-7乳房癌細(xì)胞增殖的抑制作用，此研究也表明了該胰蛋白酶抑制劑可能具有抗癌的作用。自大豆中提取的胰蛋白酶抑制劑通過下調(diào)uPA尿激酶纖維蛋白溶酶原激活物從而阻止卵巢癌細(xì)胞的擴(kuò)散，該研究同樣證實(shí)了胰蛋白酶抑制劑可能存在抗癌的生理活性。自蠶豆中提取、分離獲得了分子質(zhì)量為15kD的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑，除了可以抑制HIV-1的反轉(zhuǎn)錄酶的活性外，同時(shí)具有通過誘導(dǎo)染色質(zhì)凝聚和細(xì)胞凋亡而抑制HepG2肝腫瘤細(xì)胞增殖的能力。自宮粉羊蹄甲提取的一種新型的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑(BvvTI)，除了具有抑制HIV-1的反轉(zhuǎn)錄酶的活性外，還可明顯地抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-1增殖作用，同時(shí)對(duì)細(xì)胞活素類和細(xì)胞凋亡都有影響。胰蛋白酶抑制劑的這些生物活性賦予了應(yīng)用于醫(yī)藥的潛力。但關(guān)于胰蛋白酶的抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞和HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制機(jī)制到目前為止還未明確，需要進(jìn)一步的研究探討。

提取及純化方法[3]

1.    從動(dòng)物臟器中提取

牛肺胰蛋白酶抑制劑(也稱抑肽酶)的分子質(zhì)量為6.2×103u，是由58個(gè)氨基酸殘基組成的堿性多肽.它的一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)均已闡明，分子內(nèi)有3對(duì)二硫鍵，整個(gè)分子呈梨型，活性中心為賴氨酸，位于分子的頂端.從分子質(zhì)量看有兩類，一類是分子質(zhì)量較大的；一類是分子質(zhì)量較小的.將化學(xué)改性與修飾殼聚糖體，共價(jià)偶聯(lián)配基牛胰蛋白酶，制成固定化酶為抑肽酶親和吸附劑，直接對(duì)黃牛肺提取液一步層析純化，再超濾脫鹽、濃縮、去熱原，凍干即抑肽酶.抑肽酶比活5.7×10

3kIU/mg，收率22×104kIU/kg(牛肺)；固定化酶單位活力2.595×103kIU/g(干)，酶活性回收率55%，非特異性吸附較小，機(jī)械強(qiáng)度高，可反復(fù)使用.

2.    從人尿中提取

人尿胰蛋白酶抑制劑(HUTI)是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，表觀分子質(zhì)量為67×103u，等電點(diǎn)為2～3.它是一種糖蛋白，糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)20%～30%.人尿中的抑肽酶不同于由牛肺、胰提取的抑酶，它對(duì)人體不產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，更適于臨床.目前提取UTI的方法有綜合使用三氯醋酸、硫酸銨、甲醇沉淀法，使用膨潤土法，使用DEAE-纖維素法，使用固定化胰蛋白酶的方法，直至最近使用的脫乙酞?dú)ざ嗵且约肮杷徭V的方法.利用純胰蛋白酶作為配體偶聯(lián)于CNBr-Sepharose4B為親和載體，在不同條件下洗脫親和蛋白，可從粗品溶液中快速分離純化具有胰蛋白酶抑制活性的兩種純產(chǎn)物.根據(jù)洗脫條件，可將有抑制活性的20×103和40×103u蛋白質(zhì)分離為兩個(gè)單獨(dú)組分或混合物.其中20×103u組分的抑制活性回收率為35%，抑制比活為3.387×103kIU/mg；40×103u組分的相應(yīng)值分別為53%和3.116×103kIU/mg.混合物的抑制活性回收率和抑制比活分別為89%和3.076×103kIU/mg.

3.    植物中提取

20世紀(jì)40年代人們發(fā)現(xiàn)植物中含有蛋白酶抑制劑，在植物貯藏器官，特別在種子中，其含量常常高達(dá)總蛋白的10%.食物中植物胰蛋白酶如果沒被除去或抑制，它在體內(nèi)能與小腸液中胰蛋白酶、糜蛋白酶結(jié)合，生成無活性復(fù)合物，消耗和降解胰蛋白酶，導(dǎo)致腸道對(duì)蛋白質(zhì)消化、吸收及利用能力下降.導(dǎo)致胰腺腫大和體內(nèi)氨基酸代謝失調(diào)等疾病.但也有報(bào)導(dǎo)大豆中微量胰蛋白酶抑制劑對(duì)于糖尿病治療、調(diào)節(jié)胰島素失調(diào)有一定效果.利用固定化胰蛋白酶分離純化大豆胰蛋白酶抑制劑可得到高純度的大豆胰蛋白酶抑制劑.研究結(jié)果表明：大豆胰蛋白酶抑制劑通過各階段純化后其活性從0.95kIU/mL增高至325.5kIU/mL，純化程度提高324.6倍，得率0.033%；電泳結(jié)果表明：利用固定化胰蛋白酶分離純化的大豆胰蛋白酶抑制劑有單譜帶，純化效果明顯.從已發(fā)表的Ti基因順序設(shè)計(jì)了引物，通過PCR技術(shù)從大豆總DNA中擴(kuò)增了Tid基因的編碼序列，從而最終獲得了Ti蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的資料.采用凝膠層析及離子交換層析等方法，從苦蕎種子中分離出一組胰蛋白酶抑制劑(TBTIⅠ、Ⅱ).對(duì)其性質(zhì)研究表明：兩個(gè)組分均對(duì)胰蛋白酶有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)胰凝乳蛋白酶抑制作用較弱，其中TBTI-Ⅱ的抑制作用大于TBTI-Ⅰ，兩者對(duì)胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及枯草桿菌蛋白酶均無抑制作用.用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和SephadexG-100凝膠層析分別對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行分析得出TBTI-Ⅰ和TBTI-Ⅱ的近似分子質(zhì)量分別為15.0×103u和18.0×103u.TBTI-Ⅰ、Ⅱ都具有較高的熱穩(wěn)定性，在100℃處理10min后可保留86%左右的抑制活性.TBTI在酸性環(huán)境下較為穩(wěn)定，在pH2.0條件下保溫1h，仍保留75%的抑制活性.用Lineveaer-Burk作圖法得知，該抑制劑屬競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型，TBTI-Ⅱ的Ki值為3.59×10-7mol/L(以BAPNA為底物)，對(duì)胰蛋白酶的摩爾抑制比為1∶1.4.以菠菜種子為材料，經(jīng)脫脂、酸性溶液抽提、熱變性、硫酸銨分部沉淀得到胰蛋白酶抑制劑粗提物，再經(jīng)離子交換、親和層析和凝膠過濾，分離得到胰蛋白酶抑制劑SOTI，純化倍數(shù)為57.22，SDS-PAGE測(cè)定其分子質(zhì)量約為22×103u，等電聚焦測(cè)定其等電點(diǎn)為4.02.SOTI具有較高的熱穩(wěn)定性，在100℃處理后仍然具有一定的抑制活性.

主要參考資料

[1] 營養(yǎng)科學(xué)詞典

[2] 胰蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展

[3] 胰蛋白酶抑制劑的研究進(jìn)展