青霉素V鉀是青霉素類β-內(nèi)酰胺類抗生素，臨床 及實驗研究證明，β-內(nèi)酰胺類抗生素引發(fā)的過敏反應(yīng)是由其中的高分子聚合物產(chǎn)生的[1-3]，更好地控制β-內(nèi)酰胺抗生素聚合物的含量，將在未來的藥品質(zhì)量控制中成為主流[3]?！吨袊幍洹?010年版采用SephadexG10凝膠柱[5]，分離測定青霉素V鉀片中的 高分子聚合物，但在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)有一些問題，如：柱效低，方法中僅要求理論塔板數(shù)不低于400；峰形拖尾，方法中只要求拖尾因子不大小于2.0 即 可；分析一個樣品包括系統(tǒng)適用性試驗和樣品測定 至少需要3個多小時；測定中使用兩種流動相和青霉 素對照品使得試驗和計算較為繁瑣等，近年來也在 不斷發(fā)展高效凝膠色譜系統(tǒng)，以克服Sephadex G10 凝膠色譜系統(tǒng)的弱點，逐步完善著對抗生素高分子聚合物的控制理念[4]。故開發(fā)更為簡單方便快捷可靠 的高效凝膠色譜測定方法解決藥典方法存在的弱點 是聚合物測定方法改進(jìn)的目的。經(jīng)過方法探索和驗 證決定采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法，照分 子排阻色譜法使用TSK-GEL G2000SWXL高效凝膠 色譜柱(7.8mm×300mm，5μm)，以低濃度的磷酸鹽 緩沖液和乙腈(95/5)為流動相，柱溫為25℃，流速為0.7mL/min，檢測波長為254nm進(jìn)行青霉素V鉀片中高分子聚合物的測定，見圖1。
1 儀器與材料
Alltech1500高效液相色譜儀(美國奧泰科技有限 公司)；色譜柱Tsk-gelG2000SWXL(7.8mm×300mm,5μm，日本東曹公司)；CP220D電子天平(德國賽多
利斯集團(tuán))。青霉素V化學(xué)對照品(批號：130490-200904， 含量：89.3%，中國藥品生物制品檢定所)；青霉素 V鉀片 (規(guī)格：0.25g，批號：AX2420、AX2421、AX2422，山德士制藥有限公司)；乙腈為色譜純(國 藥集團(tuán)化藥試劑有限公司)，水為超純水，磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等(成都市科龍化工試劑廠，AR)。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
色譜柱為Tsk-gelG2000SWXL(7.8mm×300mm，5μm)，流動相為0.06mol/L磷酸鹽緩沖液(0.06mol/L磷酸二氫鈉溶液，調(diào)pH值至7.0)/乙腈=95/5；檢測波 長為254nm，進(jìn)樣體積為20μL，柱溫為25℃，流速 為0.7mL/min，檢測波長為254nm，理論塔板數(shù)不低 于2000，色譜圖見圖2。
2.2 溶液的配制
精密稱取適量青霉素V化學(xué)對照品，加水溶解制 成含青霉素V 36μg/mL的對照品溶液；另精密稱取適量青霉素V鉀片內(nèi)容物，加水溶解制成4.0mg/mL的溶液(臨用新制) 用0.22μm的微孔濾膜過濾，棄去初 濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液，將樣品溶液置80℃ 水浴中30min，放冷至室溫用0.22μm的微孔濾膜過濾， 棄去初濾液，取續(xù)濾液作為系統(tǒng)適用性樣品溶液。
2.3 專屬性試驗
分別精密吸取青霉素V對照品溶液、供試品樣品 溶液、和高溫、光照、酸堿和氧化的強制降解樣品 溶液各20μL注入液相色譜儀，按“2.1 色譜條件”下 方法進(jìn)行分析，記錄色譜圖。結(jié)果在該色譜條件下 所有強制的條件下降解產(chǎn)物與青霉素V鉀的峰是分開 的，方法專屬性良好。
2.4 線性范圍考察
取青霉素V鉀對照品13.59mg，精密稱定，用超 純水配制成濃度為121.3587μg/mL的對照品儲備溶 液，準(zhǔn)確移取儲備液0.5、1、2、3、4、5和6mL分 別置于10mL量瓶中，用超純水稀釋定容至刻度，搖 勻即得濃度分別為6.067935、12.13587、24.27174、36.40761、48.54348、60.67935和72.81522μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別吸取20μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。以對 照品峰面積A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回 歸，其線性方程為：A=2936C+324.32(r=0.9999)。結(jié) 果表明青霉素V鉀在濃度為6.068~72.815μg/mL時與 峰面積的線性關(guān)系良好。
2.5 檢測限試驗
精密稱取本品，加超純水溶解并稀釋至濃度為0.364μg/mL，進(jìn)樣20μL時有明晰的色譜峰，信噪比為3.1(n=6，RSD=1.07%)，可認(rèn)為檢測限0.364μg/mL。
2.6 穩(wěn)定性試驗
按2.2項下新制備對照品溶液和供試品溶液(批 號：AX2420)各1份，室溫放置，按上述色譜條件分 別于0、0.5、1、2、3、4和8h進(jìn)樣分析，記錄對照品 溶液和樣品溶液各色譜圖的峰面積，得對照品溶液 主峰峰面積的RSD值為0.55%(n=6)，結(jié)果表明對照品 溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好；但供試品溶液在常溫下1h 后各個時間點其高分子聚合物雜質(zhì)的含量都在明顯 地增加，表明供試液在常溫下不穩(wěn)定，須臨用前現(xiàn)配。
2.7 精密度試驗
精密吸取2.2項下同一對照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，其峰面積的RSD =0.36%，表明儀器精密度良好。
2.8 重復(fù)性試驗
取同批青霉素V 鉀片( 規(guī)格：0.25g ，批號：AX2420) 樣品，配制成供試樣品溶液5 份( 臨用現(xiàn) 配)，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)測定其聚合物含量，按外標(biāo)法以峰面積計算其高分子聚合物含量分別為0.989%、0.984%、0.972%、0.998%、0.969%和0.991%，RSD =1.15%，結(jié)果表明分析方法重復(fù)性良好。
3 樣品測定
精密量取20μL對照品溶液，進(jìn)樣，以流速0.7mL/min照“2.1 色譜條件”下方法進(jìn)行測定，記錄色譜圖。另取20μL樣品溶液，進(jìn)樣，以流速0.7mL/min同法測定。按 外標(biāo)法以峰面積計算青霉素V鉀高分子聚合物的含量。3批樣品的測定結(jié)果如表1。
4 討論
4.1 新方法與藥典方法的比較
《中國藥典》2010年版青霉素V鉀片項下使用分子 排阻色譜法(附錄Ⅴ H)對高分子聚合物進(jìn)行測定[5]。
4.1.1 中國藥典色譜條件
以葡聚糖凝膠G-10(40~120 μ m) 為填充劑，以pH7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液[0.1mol/L磷酸氫二 鈉-0.1mol/L磷酸二氫鈉(61:39)]為流動相A，水為流動相B，流速為每分鐘1.5mL，檢測波長為254nm，進(jìn)樣體積為100~200μL，理論塔板數(shù)以藍(lán)色葡聚糖2000峰計算均不低于400，拖尾因子均應(yīng)小于2.0。
4.1.2 測定方法的比較
藥典方法規(guī)定對照溶液和樣品溶液的進(jìn)樣體積 均為100~200μL，進(jìn)樣量大，進(jìn)樣時間長，對儀器 的進(jìn)樣設(shè)備要求高，而新方法只需正常進(jìn)樣20 μ L 即可，進(jìn)樣快準(zhǔn)確。藥典方法以0.1mg/mL 藍(lán)色葡 聚糖2000溶液分別在流動相A、B中進(jìn)行測定，規(guī) 定在兩種流動相系統(tǒng)中主峰峰保留時間的比值應(yīng)在0.93~1.07之間，理論板數(shù)不低于400，拖尾因子均應(yīng)小于2.0為系統(tǒng)適用性試驗；以高聚體的峰高與單體 與高聚體之間的谷高比應(yīng)大于2.0判斷分離度[5]。而 新方法采用一種流動相進(jìn)行等度洗脫，高分子聚合物峰與青霉素V鉀主峰能夠完全分離，其主峰前峰分 離度達(dá)2.5，主峰后的峰分離度5.6，及對照峰不對稱 僅1.2，均優(yōu)于其他條件。主峰的理論塔板數(shù)均不低 于2000，按外標(biāo)法以峰面積計算青霉素V鉀高分子聚 合物的含量。分別用藥典方法和新的聚合物測定方 法對3批樣品的高分子聚合物含量進(jìn)行測定，測定結(jié) 果如表2。
比較表1~2 中兩種方法的高分子聚合物測定結(jié) 果，新方法中高分子聚合物峰與青霉素V鉀主峰分離 效果較好，達(dá)到基線與基線分析，分離度大于1.5，且高分子聚合物峰和青霉素V主峰能夠完全分離,分 析時間明顯縮短，只需25min便能完成一個供試樣品 的分析；而藥典方法在分析供試樣品前要進(jìn)行大量 的系統(tǒng)適用性試驗，并且是以高聚體的峰高與單體 與高聚體之間的谷高比判斷分離度，樣品分析時間 較長，分析一個樣品要用60min。因此，采用文中所 述新的高分子聚合物含量測定方法較好地解決了藥 典方法柱效低、峰型拖尾、重復(fù)性不好和分析時間 較長等問題；較藥典方法更為簡便快捷。
4.2 新方法色譜條件的確定情況
檢測波長的選擇：參照2010年版《中國藥典》二部中收載的青霉素V鉀片聚合物測定方法。
流動相選擇：磷酸鹽緩沖液的濃度分別調(diào)整為0.04、0.05、0.06和0.07mol/L配制成流動相，進(jìn)樣記錄色 譜圖分析。當(dāng)緩沖液濃度為0.06mol/L，與乙腈的比例為95:5時，高分子聚合物峰和青霉素V鉀主峰的分離效果好，因此，磷酸鹽緩沖液的濃度選擇為0.06 mol/L。