1、 儲(chǔ)存液制備
（1）潮霉素 B（粉末形式）：稱取適量粉末溶于 1×PBS 配制成 50mg/ml 溶液，用 0.22μm 濾膜過(guò)濾除菌，置于 2-8°C 避光保存。
（2）潮霉素B（溶液形式）：已是無(wú)菌儲(chǔ)存液，直接用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到工作濃度即可使用。
2、 建議工作濃度
潮霉素B 用來(lái)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的工作濃度需要根據(jù)細(xì)胞類型，培養(yǎng)基，生長(zhǎng)條件和細(xì)胞代謝率而變化。
（1）哺乳動(dòng)物細(xì)胞 使用濃度為 50-1000 μg/ml，常用篩選濃度為 200 μg/ml，濃度需要?dú)缜€來(lái)確定。
（2）植物細(xì)胞 常用濃度：20-200 μg/ml；
（3）細(xì)菌常用濃度：20-200 μg/ml；
（4）真菌 常用濃度：200-1000 μg/ml；
3、 殺滅曲線的建立
建議初次實(shí)驗(yàn)一定要建立殺滅曲線（kill curve），至少設(shè)立 5 個(gè)濃度，篩選到適合自身實(shí)驗(yàn)體系的濃度。
（1）將未轉(zhuǎn)化細(xì)胞按照 20-25%的細(xì)胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上，鋪?zhàn)銐虻目滓员ＷC后續(xù)的梯度實(shí)驗(yàn)。37℃ 培養(yǎng)過(guò)夜；【注意】：對(duì)于需要更高密度以保證活力的細(xì)胞，增加接種量。
（2）第二日，用含梯度濃度潮霉素 B 的培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基。比如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞常用濃度為 50-1000μg/ml， 可設(shè) 50, 100, 250, 500, 750, 1000μg/m 這 6 個(gè)濃度，各 3 個(gè)平行。同時(shí)設(shè)置一陰性對(duì)照，3 個(gè)平行。
（3）接下來(lái)每 3-4 日更換新鮮的含抗生素培養(yǎng)基。
（4）按照固定周期（如每 2 天）進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)確定阻止未轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)的恰當(dāng)濃度。選擇在理想天數(shù)（通常是 7-10 天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的最低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選所需的工作濃度。
4、 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的篩選
（1）轉(zhuǎn)染 48h 后，用含篩選濃度潮霉素 B 的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞傳代?！咀⒁狻浚杭?xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷效果。當(dāng)細(xì)胞密度過(guò)高，篩選效率會(huì)降低。為了得到較好的篩選效果，建議將細(xì)胞稀釋至豐度不超過(guò)25%。
（2）每 3-4 日更換新鮮的含抗生素培養(yǎng)基。
（3）篩選 7 天后觀察并評(píng)估細(xì)胞集落的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間，這些取決于宿主細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染，以及篩選效果。
（4）挑取 5-10 個(gè)抗性克隆到 35mm 細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。
（5）之后換用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。

1. The structural basis for the action of the antibiotics tetracycline,
pactamycin, and hygromycin B on the 30S ribosomal subunit.
Brodersen, D. E., Clemons Jr, W. M., Carter, A. P., Morgan-Warren, R. J., Wimberly, B. T., & Ramakrishnan, V.
Cell, 103(7), 1143-1154. (2000).

2. Resistance to hygromycin B.
Waldron, C., Murphy, E. B., Roberts, J. L., Gustafson, G. D., Armour, S. L., & Malcolm, S. K.
Plant Molecular Biology, 5(2), 103-108. (1985).