MTT檢測試劑盒

中文名稱：MTT檢測試劑盒
英文名稱：MTT Assay Kit
產(chǎn)品規(guī)格：500次
MTT廣泛用于檢測細胞生長，其原理是MTT可以被活細胞線粒體內的脫氫酶還原生成深紫色的formazan結晶，而死細胞則無此活性。深紫色的formazan結晶被溶解后可以通過測定490nm波長的光吸收而測定出其濃度，并由此推測出細胞的活力，細胞增殖越旺盛，則吸光度越高；細胞毒性越大，則吸光度越低。其原理如下：


產(chǎn)品特點：
1．采用獨特的Formazan溶解液，可以充分溶解formazan，減少誤差。
2．背景低，靈敏度高，線性范圍寬，重復性好。
3．本產(chǎn)品為足夠500次(5個96孔細胞培養(yǎng)板)微孔板檢測。
4．可用于生物活性因子活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性測定等。

試劑盒組成：

儲存條件：低溫運輸、-20℃保存(但溶液B也可以常溫運輸和保存)，有效期一年。

使用方法：
下面操作是檢測細胞毒性的試驗，其他應用跟此類似或更簡單(如生長曲線試驗)，操作步驟可以以此為基礎稍作修改即可，故不再贅述。

㈠、接種細胞
1．按常規(guī)胰酶消化法消化匯合的單層細胞，收集到含血清的培養(yǎng)基中。
2．200g離心5分鐘收集細胞沉淀。
3．用培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，制備成單細胞懸浮液并計數(shù)。
4．將細胞稀釋到2.5×103個/mL～5×10個/mL之間(需要根據(jù)細胞的生長速度決定)，如果不知道生長數(shù)度，一般可以稀釋到1×10個/mL。
5．將足夠量的細胞懸液轉移到培養(yǎng)皿中(便于用排槍取樣)。一個96孔板的MTT檢測需要約20mL的細胞懸液。
6．用排槍在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL細胞懸液(對正常細胞)。如果是腫瘤細胞，則加入100μL腫瘤細胞懸液和100μL培養(yǎng)基(總體積為200μL)。注意：一定要把細胞加在孔的正中，否則細胞會聚集在孔的角落處，影響試驗。
7．用排槍在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟細胞懸液等體積的培養(yǎng)基。第1 列各孔將作為+培養(yǎng)基-細胞+MTT對照(用于測OD時調零)，第12列加培養(yǎng)基的作用是減少邊緣效應對第11 列反應的影響。
8．按常規(guī)細胞培養(yǎng)方法在37℃和5% CO2條件下孵育1-3天，使細胞進入指數(shù)生長期。

㈡、藥物處理
9．用培養(yǎng)基將藥物稀釋到8個待測濃度(如果不知道待測濃度，則需要預試驗確定)，一般一種藥物需要做3塊平行板。
10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培養(yǎng)基(不要觸動細胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培養(yǎng)基。
11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鮮培養(yǎng)基，這些孔將作為+培養(yǎng)基+細胞-藥物的對照。
12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8個濃度梯度的待測藥物，每列加入一個濃度的藥物。
13．按常規(guī)方法把96孔板繼續(xù)放在在37℃和5% CO2條件下孵育一定的時間，此段時間即為藥物處理細胞的時間，由用戶自己決定。
14．處理結束后去除第2 到第11列(共10列，均含細胞)所有孔中的培養(yǎng)基，并再加入100μL新鮮培養(yǎng)基。
15．每天換培養(yǎng)使細胞數(shù)量擴增2-3倍(所需時間隨細胞不同而不同)。

㈢、存活細胞計數(shù)
16．在生長末期，去除第1到第11列各孔中的培養(yǎng)基后，再加入100μL新鮮培養(yǎng)基和10μL溶液A(含MTT成分)，用錫箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-8小時。注意：溶液A在低溫情況下會凝固，使用前請室溫放置或20-25℃水浴至全部溶解，搖勻后使用。MTT有致癌性，一定要帶手套操作。
17．小心吸棄孔內培養(yǎng)基(含溶液A)。由于培養(yǎng)基可能會影響光吸收，盡可能去除。
18．每孔加入100μL溶液B，置搖床上低速振蕩10分鐘，使MTT形成的formazan結晶物充分溶解。
19．由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，故需要立即在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490nm測定吸光度。
 注意：用第1 列各孔(+培養(yǎng)基-細胞+MTT對照)調零。
20．計數(shù)同樣處理的各次重復的平均值。
21．以藥物濃度為橫軸，以吸光度為縱軸繪制曲線。由于各處理吸光度絕對值差別很大，一般需將其轉化成生長抑制率(以不加藥物的第2和第11列各孔數(shù)據(jù)的平均數(shù)作為100%)，這樣便于計算出IC50，用于各種藥物處理效果的比較。注意：如果測生長曲線，則以時間為橫軸。正常生長曲線一般呈現(xiàn)S型，具有促進作用的則斜率加大。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！