TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

英文名稱： TUNEL
中文名稱：TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒
別    名：TUNEL Apoptosis Assay Kit; In Situ Cell Death Detection Kit;  
保存條件：Store at -15 to -25℃

The In Situ Cell Death Detection Kit, POD is based on the detection of single- and double-stranded DNA breaks that occur at the early stages of apoptosis. Apoptotic cells are fixed and permeabilized. Subsequently, the cells are incubated with the TUNEL reaction mixture that contains TdT and fluorescein-dUTP. During this incubation period, TdT catalyzes the addition of fluorescein-dUTP at free 3'-OH groups in single- and double-stranded DNA. After washing, the label incorporated at the damaged sites of the DNA is marked by an anti-fluorescein antibody conjugated with the reporter enzyme peroxidase. After washing to remove unbound enzyme conjugate, the POD retained in the immune complex is visualized by a substrate reaction.

凋亡是許多正常的生理過程所必需的，包括免疫系統(tǒng)的成熟和作用機制、組織器官和肢體的發(fā)生、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生等過程。在許多病理條件下，凋亡機制的調(diào)節(jié)失衡起很重要的作用，包括組織細(xì)胞的缺血、缺氧、出血、中風(fēng)、心臟病、癌癥、艾滋病、自身免疫缺損和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性變等。在癌基因的研究方面，由于細(xì)胞凋亡可由抗癌藥物、放射及高熱等啟動，并且腫瘤細(xì)胞具有由于一些癌基因表達即能啟動凋亡的內(nèi)在特性，因此細(xì)胞凋亡已引起人們的廣泛重視。
檢測凋亡細(xì)胞的方法有數(shù)種。細(xì)胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶的活化是關(guān)鍵的過程，導(dǎo)致核DNA被裂解成寡核苷酸大小的片段。因此，這個過程被用于檢測凋亡，在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)典型的“DNA梯形帶”。但是，這種方法既不能檢測單個細(xì)胞水平的凋亡，又不能提供細(xì)胞發(fā)生凋亡所處的組織位置和細(xì)胞分化狀態(tài)等方面的信息。
這一切可以由凋亡的原位酶標(biāo)記方法來完成。DNA聚合酶和末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）用來標(biāo)記DNA鏈斷端的核酸，應(yīng)用TdT進行的末端反應(yīng)又稱為ISEL或TUNEL技術(shù)，它與應(yīng)用DNA聚合酶的ISNT（in situ nick translation）相比具有以下優(yōu)點：靈敏度高、快速、優(yōu)先標(biāo)記發(fā)生凋亡的細(xì)胞，而不是壞死的細(xì)胞。
本試劑盒檢測細(xì)胞凋亡分以下三個步驟：1、標(biāo)記DNA鏈斷端，由TdT催化，以FITC標(biāo)記的核苷酸為原料，進行非模板依賴方式的3?OH端DNA末端聚合反應(yīng)；2、用HRP或AP標(biāo)記的羊抗FITC的抗體（Fab段）與聚合到DNA末端的FITC結(jié)合；3、用酶的底物顯色，HRP常用DAB顯色，AP常用BCIP/NBT顯色。

方法：雙抗夾心法

保質(zhì)期：12個月

測定長度： 1-4.5小時 1-3.5小時

優(yōu)點：

有競爭力的價格。             預(yù)稀釋的檢測試劑A和B

高靈敏度。                   減少進行測試時的步驟數(shù)

高穩(wěn)定性。                   所有試劑均可在4℃下保存

保質(zhì)期12個月。              與其他品牌相比反應(yīng)更快

                             保質(zhì)期12個月

包裝描述：

測定步驟總結(jié)

1.準(zhǔn)備所有試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品；

2.向每個孔中添加100µL標(biāo)準(zhǔn)液或樣品。在37℃下孵育2小時；

3.吸出并加入100µL準(zhǔn)備好的檢測試劑A。在37℃孵育1小時；

4.吸凈并清洗3次；

5.加入100µL制備的檢測試劑B。在37℃孵育1小時；

6.吸氣并清洗5次；

7.添加90µL底物溶液。在37℃下孵育15-25分鐘；

8.添加50µL終止液。立即在450nm處讀取。

需自備的設(shè)備及試劑

450±10nm濾光片的酶標(biāo)儀(建議儀器使用前提前預(yù)熱)

單道或多道微量加液器及吸頭

稀釋樣品的EP管

蒸餾水或去離子水

吸水紙

盛放洗液的容器

試劑盒的儲存及有效期

未開封的試劑盒：所有試劑均按試劑瓶標(biāo)簽上所示保存。請注意，收到試劑盒后請盡快將TMB 洗滌液，終止液保存于4℃，其他試劑保存于-20℃。

使用后的試劑盒：剩余試劑仍需按照試劑瓶標(biāo)簽所示的溫度保存，開封后的酶標(biāo)板要加干燥劑后密封保存于-20℃，避免潮濕。

穩(wěn)定性

經(jīng)測定，試劑盒在有效期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性降低率小于5%。

為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響，實驗室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實驗室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實驗員來進行操作可減少人為誤差。

注意：

試劑盒內(nèi)酶標(biāo)條可拆卸，按實驗需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在首次實驗后 1個月內(nèi)使用完畢。產(chǎn)品過期時間以盒子上的標(biāo)簽為準(zhǔn)，保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。

ELISA實驗常見問題分析

ELISA實驗因靈敏度高，特異性強在生物科研上得到了廣泛的認(rèn)可，但對初學(xué)者而言，如不注意實驗操作過程中的各個環(huán)節(jié)，可能會對最終的實驗結(jié)果產(chǎn)生比較大的影響，比如實驗出現(xiàn)白板，顯色弱靈敏度低，花板無梯度背景高等現(xiàn)象。下面對以上實驗現(xiàn)象進行一一解析。

1.白板現(xiàn)象

在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標(biāo)板中所有孔的顏色均為無色，即無信號呈現(xiàn)。

出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：

a.試劑已過保質(zhì)期，不同批次稀釋液交叉使用。

b.錯加漏加檢測A，檢測B或者底物溶液TMB。

c.洗板或者加樣過程中，酶標(biāo)記物被污染失活，稀釋液中含有酶抑制劑如疊氮吶等。

d.配置稀釋液的蒸餾水可能被污染。

e.洗滌液是濃縮型的，沒有按比例進行稀釋。

f.酶標(biāo)記物的活性和效價比較低。

g.溶液的PH值不正確，一般稀釋液的PH值應(yīng)保持在7.2-7.4。

2.顯色弱靈敏度低

在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標(biāo)板中孔的顯色比較淺，即只有微弱的信號呈現(xiàn)。

出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：

a.產(chǎn)品過有效期，試劑沒有按規(guī)定進行適當(dāng)?shù)谋４妗?/p>

b.試劑，標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品在使用前沒有平衡到室溫。

c.少加了試劑的量或者加入試劑的稀釋比例不當(dāng)。

d.洗板或者加樣過程中，酶標(biāo)物受污染失活。

e.孵育時間和孵育溫度未達到實驗要求。

f.洗滌液稀釋倍數(shù)不符合要求，洗板次數(shù)過多，洗板沖擊力過大，洗板浸泡時間過長。

g.底物溶液TMB顯色時間太短。

3.花板無梯度背景高

在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標(biāo)板中的孔有顏色但沒有梯度，背景也可能較高.

出現(xiàn)該現(xiàn)象的可能原因：

a.底物溶液TMB未置于陰涼避光處保存，實驗前溶液已經(jīng)變藍。

b.孵育溫度過高或者孵育時間過長，發(fā)生了較強的非特異性吸附。

c.沒有按說明書要求洗板，特別是洗板時洗滌液的量少加了。

d.加樣時沒有換槍頭造成交叉污染。

e.花板現(xiàn)象：低濃度或者低活性的包被抗體或者檢測抗體，封閉不足導(dǎo)致的本底不穩(wěn)定，洗板不充分，包被板子的問題。

綜上所述：在ELISA實驗中應(yīng)注意以下問題：

1.在實驗前應(yīng)該按相關(guān)要求將實驗試劑平衡至室溫。

2.包被抗體和檢測抗體應(yīng)該是有高活性的且都針對同一抗原。

3.試劑保存：蛋白抗體類試劑保存于-20攝氏度，顯色液洗滌液保存于2-8攝氏度。

4.各試劑在使用前應(yīng)充分混勻，以保證試劑的均一性和準(zhǔn)確性。

5.嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)試劑。

6.洗板次數(shù)，洗板液的量，洗板液浸泡時間的長短，洗板的力度都是應(yīng)該注意的問題。

7.相關(guān)濃縮液應(yīng)按要求稀釋到相應(yīng)比例方可使用，PH值要保持在7.2-7.4之間。

8.在終止反應(yīng)時盡量避免微孔中存有氣泡。

9.終止反應(yīng)完成后應(yīng)該在2min內(nèi)完成酶標(biāo)儀讀數(shù)。