桿狀病毒穿梭載體bacmid小量抽提試劑盒

信裕生物生產(chǎn)的桿狀病毒穿梭載體bacmid小量抽提試劑盒(Baculovirus Shuttle Vector Bacmid Mini Preparation Kit, 簡稱Bacmid Miniprep Kit)是一種從大腸桿菌DH10Bac中簡單快速抽提高質(zhì)量可完美應(yīng)用于昆蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)染的bacmid的試劑盒。
主要特點(diǎn)：簡單快速，不使用劇毒試劑，無須酚氯仿抽提，無須過柱純化，有效解決bacmid分子量大、抽提難度高等系列問題，確保抽提獲得的bacmid可完美用于昆蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
當(dāng)目的基因被插入到pFastBac系列載體中構(gòu)建成目的重組質(zhì)粒后，該重組質(zhì)?？捎糜谵D(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac從而發(fā)生位點(diǎn)特異的轉(zhuǎn)座(site-specific transposition)，藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定篩選含有重組bacmid的重組子，再使用本試劑盒進(jìn)行bacmid的小量抽提即可獲得可轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞的bacmid DNA。
本試劑盒在抽提bacmid的同時(shí)，也會(huì)抽提輔助質(zhì)粒(helper plasmid)和未重組的pFastBac質(zhì)粒。抽提獲得的bacmid等質(zhì)?；旌衔锟梢灾苯佑糜谵D(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞以包裝桿狀病毒，最終用于目的蛋白在昆蟲細(xì)胞中的大量表達(dá)。
Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是由Luckow等人于1993年發(fā)展的一種快速而有效產(chǎn)生重組桿狀病毒的方法。該系統(tǒng)主要包括以下兩個(gè)組分：(1)用于插入目的基因的pFastBac載體，目的基因插入后受桿狀病毒特異性啟動(dòng)子(baculovirus-specific promoter)調(diào)控表達(dá)；(2)含桿狀病毒穿梭載體bacmid (bMON14272, 136kb)和輔助質(zhì)粒(helper plasmid，用于表達(dá)轉(zhuǎn)座必須的轉(zhuǎn)座蛋白)的大腸桿菌DH10Bac宿主菌株。將pfastBac重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化該菌株可發(fā)生pfastBac重組質(zhì)粒中mini-Tn7元件和bacmid上的mini-attTN7發(fā)生轉(zhuǎn)座，從而形成重組的bacmid。
利用Bac-to-Bac桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白主要包括以下實(shí)驗(yàn)步驟：(1)把目的基因克隆到pFastBac載體產(chǎn)生重組質(zhì)粒；(2)轉(zhuǎn)化pFastBac重組質(zhì)粒到DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)生重組bacmid；(3)利用桿狀病毒穿梭載體bacmid小量抽提試劑盒提取重組bacmid DNA；(4)將重組bacmid DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入昆蟲細(xì)胞(推薦使用信裕生物的C0551 LipoInsect™轉(zhuǎn)染試劑)以產(chǎn)生重組桿狀病毒；(5)擴(kuò)增重組的桿狀病毒并用其感染昆蟲細(xì)胞以大規(guī)模表達(dá)重組目的蛋白。
本試劑盒抽提獲得的高質(zhì)量bacmid DNA可以直接用于轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，信裕生物生產(chǎn)的LipoInsect™轉(zhuǎn)染試劑(C0551)適用于將pFastBac等桿狀病毒表達(dá)載體制備的bacmid轉(zhuǎn)染到Sf9、Sf21和High Five™等昆蟲細(xì)胞以用于Bac-to-Bac®、BaculoDirect™和InsectSelect™表達(dá)系統(tǒng)的蛋白表達(dá)。LipoInsect™轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率非常高，對(duì)昆蟲細(xì)胞Sf9的實(shí)測(cè)陽性率可達(dá)98%以上。
關(guān)于昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)的蛋白表達(dá)與純化的詳細(xì)介紹，請(qǐng)見如下網(wǎng)頁： http://www.beyotime.com/support/insect cell.htm。 
一個(gè)包裝的本產(chǎn)品可以進(jìn)行50次bacmid的小量抽提。
包裝清單：

保存條件：
室溫保存，一年有效。
注意事項(xiàng)： 
次使用前把試劑盒提供的RNase A全部加入到溶液I (懸浮液)中，混勻，并在瓶上做好標(biāo)記。加入RNase A后須4℃存放。
溫度較低時(shí)，溶液II和溶液III可能會(huì)有沉淀產(chǎn)生。使用前必須檢查一遍。如有沉淀，37℃水浴加熱溶解，混勻后使用。
溶液II請(qǐng)勿過分劇烈混勻，否則會(huì)產(chǎn)生大量氣泡。
溶液II使用完后，請(qǐng)注意蓋緊瓶蓋，以避免被空氣中二氧化碳酸化。
本試劑盒所有操作均在室溫進(jìn)行，操作時(shí)無需冰浴。所有離心也均在室溫進(jìn)行，但在4℃進(jìn)行離心也是可以的。
溶液II有強(qiáng)堿性，溶液II和溶液III對(duì)人體都有刺激性，操作時(shí)請(qǐng)小心，并注意適當(dāng)防護(hù)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 取少量pFastBac重組質(zhì)粒加入DH10Bac感受態(tài)，稍混勻后冰上靜置30分鐘，42℃熱激90秒，加入500μl SOC培養(yǎng)液培養(yǎng)4h。隨后涂板于已提前涂好X-gal (90mm瓊脂板涂40μl 2% X-gal)的含7μg/ml慶大霉素(gentamicin)、100μg/ml卡那霉素(kanamycin)、10μg/ml四環(huán)素(tetracycline)和40μg/ml IPTG的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。
2. 培養(yǎng)48小時(shí)后挑取白斑至3ml SOC培養(yǎng)液(含7μg/ml慶大霉素、100μg/ml卡那霉素和10μg/ml四環(huán)素)中37℃ 200rpm培養(yǎng)過夜。
3. 取過夜菌1.5ml，10000g離心1分鐘收集細(xì)菌，棄上清。再加入1.5ml過夜菌，同前再次離心收集一次，每管共收集3ml過夜菌。
4. 加入300μl溶液I (已添加RNase A)，重懸細(xì)菌沉淀。確保沉淀完全散開，無可見細(xì)菌團(tuán)塊。
5. 加入300μl溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，使細(xì)菌完全裂解，溶液透明。如果發(fā)現(xiàn)還沒有完全透明，可增加顛倒次數(shù)3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時(shí)間不要超過5分鐘。切勿vortex！
6. 加入300μl溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產(chǎn)生。>12000g離心10分鐘，吸取上清至一潔凈的2ml離心管中。如果上清中仍有少量不溶物，可以>12000g離心5-10分鐘，取出上清，確保上清澄清透明，無不溶物。
7. 于上清中緩慢加入已預(yù)冷的800μl異丙醇中，顛倒混勻，冰上放置10min，>12000g離心10分鐘后，棄上清。
8. 沉淀用500μl已預(yù)冷的70%乙醇重懸，>15000g離心5分鐘，棄上清。
9. 沉淀再次用200μl已預(yù)冷的70%乙醇重懸，>12000g離心5分鐘后，棄上清。
10. 沉淀室溫干燥，待乙醇揮發(fā)后，用20μl本試劑盒提供的TE溶解，-20℃保存。
11. 后續(xù)如有必要可以對(duì)抽提獲得的Bacmid進(jìn)行PCR鑒定，以確定是否含有插入的目的片段。經(jīng)測(cè)試按照上述步驟抽提獲得的Bacmid可以完美用于昆蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑(如信裕生物的C0551 LipoInsect™轉(zhuǎn)染試劑)直接轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞。

常見問題：
1. 轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)后平板上沒有藍(lán)斑，所有克隆均為白斑：
a. 藍(lán)白斑顯色時(shí)間不夠。需37℃培養(yǎng)至少48小時(shí)后才能鑒別。
b. 轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)時(shí)間不夠。涂板前轉(zhuǎn)化菌需在SOC培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至少4小時(shí)。
c. 平板配置時(shí)，忘記加入IPTG和X-gal了。平板須已提前涂好X-gal (90mm平板涂40μl 2% X-gal)并含7μg/ml慶大霉素、100μg/ml卡那霉素、10μg/ml四環(huán)素和40μg/ml IPTG。
d. 平板上克隆太多，太密。稀釋后涂板。
e. 平板配制時(shí)間過久或者存放于有光處。含有多種抗生素的平板超過4個(gè)星期通常就不能使用，且需避光保存。
2. 所有克隆都是藍(lán)色：
a. pFastBac1重組質(zhì)粒質(zhì)量不好或已降解。使用經(jīng)過電泳檢查的高純度pFastBac1重組質(zhì)粒。
b. 可能沒加慶大霉素。需嚴(yán)格按照相應(yīng)方法來配制藍(lán)白斑篩選平板。
3. 克隆數(shù)量很少：
a. 轉(zhuǎn)化菌在SOC培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)間不夠。涂板前轉(zhuǎn)化菌需在SOC培養(yǎng)基中至少培養(yǎng)4小時(shí)。
b. 轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)后使用的是LB培養(yǎng)基而不是SOC培養(yǎng)基。需使用SOC培養(yǎng)基至少37℃培養(yǎng)4小時(shí)或30℃培養(yǎng)6小時(shí)。
4. 藍(lán)白斑難以區(qū)分：
a. LB平板培養(yǎng)基配制的pH不對(duì)?？墒褂眯旁Ｉ锷a(chǎn)的BeyoPure™ LB Broth with Agar (premixed powder) (ST158)配制平板，并確保調(diào)節(jié)pH至7.0。
b. 37℃培養(yǎng)時(shí)間太短。涂板48小時(shí)后再進(jìn)行觀察。
c. IPTG濃度不對(duì)。需要優(yōu)化IPTG濃度，通常IPTG濃度范圍為20-60μg/ml。
5. bacmid DNA發(fā)生了降解：
a. bacmid儲(chǔ)存不當(dāng)。bacmid應(yīng)在-20℃保存，并盡量避免反復(fù)凍融。
b. 提取大分子量的bacmid時(shí)，操作手法過于劇烈。抽提bacmid時(shí)，不要使用vortex，不能劇烈混合，操作須盡量溫和。