酵母質(zhì)粒小量抽提試劑盒

信裕生物生產(chǎn)的酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒(Yeast Plasmid Mini Preparation Kit)是一種使用破壁酶(Lyticase)消化去除酵母細胞壁，然后采用一種新型的酵母質(zhì)粒純化柱實現(xiàn)從酵母細胞中進行小量質(zhì)?？焖俪樘岬脑噭┖?。
無需酚氯仿抽提，無需酒精沉淀，12個樣品只需約1-1.5小時即可完成。
試劑盒提供了破壁酶(Lyticase)，酵母收集后，加入Lyticase消化去除細胞壁，接著采用傳統(tǒng)堿裂法裂解細胞，然后將獲得的上清液轉(zhuǎn)移至結(jié)合柱結(jié)合DNA，經(jīng)過離心快速洗滌，最后用洗脫液洗脫出酵母質(zhì)粒DNA。
由于采用了高濃度的破壁酶，無需再使用玻璃珠，可以避免因為玻璃珠的機械作用帶來的酵母基因組DNA污染。
每個質(zhì)粒純化柱可以結(jié)合的質(zhì)粒量的上限約為20微克。質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量依賴于酵母攜帶質(zhì)粒的拷貝數(shù)，酵母菌株以及生長條件。通常酵母質(zhì)粒的拷貝數(shù)較低，1.5-5ml培養(yǎng)過夜的酵母抽提獲得的質(zhì)粒DNA量約為1-3微克左右。高拷貝酵母質(zhì)粒抽提時的得率會大大提高。抽提所得質(zhì)粒的量與酵母培養(yǎng)濃度、質(zhì)?？截悢?shù)、酵母品系等因素有關(guān)。
使用本試劑盒抽提得到的酵母質(zhì)粒DNA可用于各種常規(guī)分子生物學(xué)實驗，如轉(zhuǎn)化、PCR、基于PCR的突變、體外轉(zhuǎn)錄、酶切、測序、文庫篩選等。
包裝清單：

保存條件：
D0029-8需-20℃保存，其余室溫保存，一年有效。D0029-8為粉末，短時間4℃存放不影響其活性。D0029-8配制成Lyticase溶液后4℃可以保存1個月，-20℃可以保存6個月。
注意事項：
次使用前把試劑盒提供的RNase A全部加到溶液Ⅰ(懸浮液)中，混勻，并在瓶上做好標(biāo)記。加入RNase A后4℃存放。
次使用前在每瓶溶液Ⅳ(洗滌液)中加入27ml無水乙醇，混勻，并在瓶上做好標(biāo)記。
次使用前吸取1ml Lyticase配制液到Lyticase粉末中，完全溶解后即為Lyticase溶液。配制好的Lyticase溶液4℃可以保存1個月，-20℃可以保存6個月。如需-20℃保存，能適當(dāng)分裝。Lyticase溶液配制后或凍存后再溶解可能會出現(xiàn)輕微混濁，屬正常現(xiàn)象，請混勻后使用。
溫度較低時，溶液Ⅱ和溶液Ⅲ可能會有沉淀產(chǎn)生。使用前必須檢查一遍。如有沉淀，37℃水浴加熱溶解，混勻后使用。溶液Ⅱ請勿過分劇烈混勻，否則會產(chǎn)生大量氣泡。
溶液Ⅱ使用完后，一定要蓋緊瓶蓋，防止被空氣中二氧化碳酸化。
溶液II有強堿性，溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和Lyticase對人體有刺激性，操作時請小心，并注意適當(dāng)防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
本試劑盒所有操作均在室溫進行，操作時無需冰浴。所有離心也均在室溫進行。
廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 取過夜菌至50毫升離心管內(nèi)，5000g離心1分鐘收集細菌沉淀，棄上清。再重復(fù)一次，每管共收集100毫升過夜菌沉淀。
通常大腸桿菌宜用LB培養(yǎng)過夜(16小時左右)至OD值為2-4。建議5000g(通常為5000rpm左右)室溫離心1分鐘，如沉淀不充分則適當(dāng)延長離心時間。時間過長或離心速度過快會使沉淀過于緊密，不利于加入溶液I后散開沉淀。直接倒掉上清，再倒入約50毫升菌液并重復(fù)上述操作，然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙)，使液體流盡。如果細菌密度明顯偏低，可考慮使用更多菌液，再重復(fù)上述操作1-2次。對于高拷貝質(zhì)粒所用菌量每管一般不能超過150毫升，對于低拷貝質(zhì)粒所用菌量每管一般不能超過200毫升。過量的細菌會導(dǎo)致后續(xù)的裂解不充分。
2. 每管加入5毫升溶液I，重懸細菌沉淀。確保沉淀完全散開，無可見細菌團塊。
確認溶液I中已添加了RNase A。最高速度vortex 10-20秒或更長時間，懸起沉淀。一定要充分混勻，對著光亮處觀察應(yīng)呈均勻的懸濁液，無明顯細菌團塊或絮塊。如果沒有vortex，可以用槍吹打沉淀使沉淀逐漸散開，或手指把沉淀彈開。
3. 每管加入5毫升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，室溫放置1-2分鐘，使細菌完全裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會導(dǎo)致基因組DNA斷裂，易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒被基因組DNA污染。顛倒4-6次后，溶液應(yīng)變得透明，無團塊或絮狀物。如果加入溶液I后細菌沒有完全散開，那么顛倒4-6次后，可能還會有團塊或絮狀物。遇到有少量團塊或絮狀物產(chǎn)生的情況，可以增加顛倒次數(shù)3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時間不可超過5分鐘。
4. 每管加入7毫升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產(chǎn)生。
切勿vortex！顛倒次數(shù)也不宜過多，否則易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒的質(zhì)量下降。
5. 12,000-14,000rpm)室溫離心10分鐘。
如果離心機的最高速度較低，需要適當(dāng)延長離心時間，例如約5000-6000rpm時需要離心20-30分鐘或更長時間，直至沉淀充分。離心時可以準備好質(zhì)粒純化柱，自制漏斗等，并在純化柱上標(biāo)上記號。
6. 將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質(zhì)粒純化柱內(nèi)。12,000-14,000rpm離心2分鐘，倒棄收集管內(nèi)液體。
質(zhì)粒倒入質(zhì)粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。本步驟及后續(xù)需要12,000-14,000rpm離心2分鐘的步驟，如果離心機的最高速度較低，需要適當(dāng)延長離心時間，例如約5000-6000rpm時需要離心約5分鐘或更長時間，直至液體全部穿柱。如果離心后有少量漂浮物，可以考慮再次離心，或者使用擦鏡紙兩次對折后打開形成的自制漏斗，以過濾去除漂浮物。
7. 在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入12毫升溶液IV，12,000-14,000rpm離心2分鐘，洗去雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體。
加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。
8. 12,000-14,000rpm再次離心2分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發(fā)。
注意：倒棄收集管內(nèi)液體后再離心，才能徹底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會影響質(zhì)粒的質(zhì)量。
9. 將質(zhì)粒純化柱置于50毫升離心管上，加入2毫升溶液V至管內(nèi)柱面上，放置2分鐘。
也可以用重蒸水或MilliQ級純水替代溶液V，但是水的pH應(yīng)不小于6.5。溶液V加入后放置時間稍長，對于增加質(zhì)粒產(chǎn)量會略有幫助。如想得到較高濃度的質(zhì)粒，可以加入1毫升溶液V洗脫，質(zhì)粒得率實測減少約5-10%，具體減少量與特定樣品有關(guān)。
10. 12,000-14,000rpm離心2分鐘，所得液體即為轉(zhuǎn)細胞級超純質(zhì)粒。
通常所得質(zhì)粒濃度為0.1-0.3mg/ml左右，可以用于細胞轉(zhuǎn)染。如果想得到高濃度的質(zhì)粒，可以采用如下的異丙醇沉淀方法濃縮質(zhì)粒或常規(guī)的乙醇沉淀方法。
a. 加入0.7倍體積的常溫異丙醇(例如1毫升待濃縮質(zhì)粒中加入0.7毫升異丙醇)，混勻后1,2000-14,000rpm 4℃離心10分鐘，小心吸去上清液，避免觸及沉淀。
如果希望獲得較高濃度的質(zhì)粒，在洗脫時推薦采用1毫升洗脫液進行洗脫，后續(xù)可以轉(zhuǎn)移到2毫升離心管內(nèi)進行異丙醇沉淀，這樣操作起來相對比較方便。異丙醇沉淀的DNA為玻璃狀近透明的顆粒狀沉淀，和乙醇沉淀產(chǎn)生的含鹽沉淀物相比較難觀察清楚。離心后取放離心管要盡量輕柔，避免沉淀松動或部分顆粒狀懸浮至溶液中。不推薦直接倒棄上清，直接倒棄上清時經(jīng)常出現(xiàn)直接把質(zhì)粒沉淀倒掉的情況；如果偏好直接倒棄上清，建議把上清倒棄至一潔凈離心管內(nèi)，這樣萬一沉淀被倒出，仍然可以從潔凈離心管中回收。推薦用移液槍吸去上清，并注意盡量避免吸走沉淀。
b. 加入1毫升常溫70%乙醇溶液，輕輕懸起質(zhì)粒沉淀以充分洗滌，12,000-14,000rpm 4℃離心5-10分鐘，小心吸去上清液，避免觸及沉淀。
c. 5,000-10,000rpm 4℃離心5-10秒，用20微升或200微升移液器小心吸凈殘留液體，避免觸及沉淀。
d. 肉眼觀察無明顯液體后(吸凈液體后通常在1分鐘內(nèi)即可完成干燥)，加入適當(dāng)體積的溶液(如溶液V、10mM Tris-Cl pH8.5或Milli-Q級純水)溶解DNA。
DNA樣品不能過于干燥，否則很難溶解。在弱堿性條件下溶解DNA，溶解時可用緩沖液反復(fù)沖洗管壁，使管壁上的DNA充分溶解。

附表1. EndA^- and EndA⁺ strains of E. coli.

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