pCMV-mCherry-GFP-LC3B

pCMV-mCherry-GFP-LC3B是信裕生物研發(fā)的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)紅色mCherry和綠色GFP雙標(biāo)簽的人源LC3B融合蛋白的質(zhì)粒。該質(zhì)粒含有CMV啟動(dòng)子，為卡那霉素抗性，轉(zhuǎn)染后能夠在靶細(xì)胞中高效表達(dá)帶有紅色熒光蛋白mCherry和綠色熒光蛋白GFP雙重標(biāo)簽的LC3B的融合蛋白，呈現(xiàn)明亮的紅色和綠色熒光，可以用于細(xì)胞自噬(autophagy)的研究。本質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可以使用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞株。
LC3是酵母自噬關(guān)鍵蛋白ATG8在哺乳動(dòng)物中的同源蛋白。LC3最初被分析鑒定為microtubule-associated protein 1 light chain 3 (MAP1LC3)。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亞家族，其中對(duì)于LC3B的研究最為廣泛。到目前為止，LC3B被認(rèn)為是細(xì)胞自噬信號(hào)通路最為關(guān)鍵的標(biāo)志性蛋白。LC3B是一個(gè)具有125個(gè)氨基酸殘基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了C端的22個(gè)氨基酸蛋白，從而暴露出C端的甘氨酸，人們把它命名為胞質(zhì)形式的LC3B I。在細(xì)胞自噬的過(guò)程中，其C端暴露的甘氨酸經(jīng)過(guò)一個(gè)類似泛素化的過(guò)程，以ATG7為E1樣激活酶(E1-like activating enzyme)，以ATG3為E2樣連接酶(E2-like conjugation enzyme)，以Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合物為E3樣連接酶(E3-like ligase)，在C端甘氨酸上共價(jià)連接上磷脂酰(phosphatidylethanolamine, PE)而成為L(zhǎng)C3B-PE即LC3B II。與胞質(zhì)定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬體(autophagosome)的內(nèi)膜和外膜上。在自噬體與溶酶體融合后，自噬體外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬體內(nèi)膜上的LC3B II則被溶酶體內(nèi)的蛋白酶所降解。盡管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其極強(qiáng)的疏水性，在SDS-PAGE電泳時(shí)，LC3B II比LC3B I遷移得更快，其表觀分子量分別為14kD和16kD。
自噬(Autophagy)是一種在進(jìn)化上高度保守的通過(guò)溶酶體吞噬并降解部分自身組分的細(xì)胞內(nèi)分解代謝途徑。自噬與多種生理功能有關(guān)，在饑餓等不利的環(huán)境條件下，細(xì)胞通過(guò)自噬降解多余或異常的細(xì)胞內(nèi)組分，為細(xì)胞的生存提供能量及原材料，促進(jìn)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化及對(duì)環(huán)境變化產(chǎn)生應(yīng)答。自噬異常與多種病理過(guò)程如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病、病原體感染等都有密切關(guān)系。由于細(xì)胞自噬在生理和病理過(guò)程中都有重要作用，自噬已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。
自噬小體在與溶酶體融合過(guò)程中，溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境會(huì)導(dǎo)致GFP熒光淬滅，這為追蹤GFP-LC3B的細(xì)胞定位增加了難度。mCherry是一種來(lái)自于蘑菇珊瑚(mushroom coral)的單體紅色熒光蛋白，當(dāng)其與GFP進(jìn)行LC3B的共同標(biāo)記時(shí)，在GFP被溶酶體酸性環(huán)境所淬滅的情況下，可以發(fā)出紅色熒光的mCherry因?yàn)槠渥吭降姆€(wěn)定性而被保留。因此，通過(guò)融合表達(dá)mCherry-GFP-LC3B蛋白，可以非常有效地追蹤自噬過(guò)程。
pCMV-mCherry-GFP-LC3B質(zhì)粒的主要信息如下：

pCMV-mCherry-GFP-LC3B質(zhì)粒(6116bp)的圖譜如下：

pCMV-mCherry-GFP-LC3B表達(dá)基因的詳細(xì)圖譜如下：

pCMV-mCherry-GFP-LC3B中沒有的酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that do not cut pCMV-mCherry-GFP-LC3B)包括：

pCMV-mCherry-GFP-LC3B中的單酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that cut pCMV-mCherry-GFP-LC3B once)包括：

pCMV-mCherry-GFP-LC3B質(zhì)粒中推薦使用的測(cè)序引物序列如下：
T3 primer (620-639): 5´- AATTAACCCTCACTAAAGGG-3´
T7 primer (2618-2639): 5´-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3´
pCMV-mCherry-GFP-LC3B的全序列信息請(qǐng)參考信裕生物網(wǎng)站上該質(zhì)粒的信息。
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