pCMV-GFP-p62

pCMV-GFP-p62是信裕生物自行研發(fā)的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)GFP標(biāo)簽的人源p62融合蛋白的質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有CMV啟動(dòng)子，為卡那霉素抗性，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠在靶細(xì)胞中高效表達(dá)綠色熒光蛋白GFP標(biāo)簽的p62融合蛋白，呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，可以用于細(xì)胞自噬(autophagy)的研究。本質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可以使用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞株。
p62也稱(chēng)sequestosome I (SQSTM1)，在多細(xì)胞生物(不包括植物和真菌)中高度保守，主要分布于細(xì)胞質(zhì)，也可以定位于細(xì)胞核、自噬體(autophagosome)和溶酶體(lysosome)中。p62是一種應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白，可以作為信號(hào)樞紐(signaling hub)在氨基酸感應(yīng)(amino acid sensing)和氧化應(yīng)激等許多細(xì)胞事件中發(fā)揮重要作用，并且還可以作為PKC、ERK1、mTORC1、NF-кB和caspase-8等的支架蛋白(scaffold protein)而參與相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。p62全長(zhǎng)440個(gè)氨基酸，包含一個(gè)PB1(Phox1/Bem1p)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(ZZ)，兩個(gè)核定位信號(hào)(NLS1和NLS2)，一個(gè)TB (TRAF6 binding)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)LIR結(jié)構(gòu)域(LC3-interacting region)，一個(gè)KIR結(jié)構(gòu)域(Keap1-interacting region)，和一個(gè)C端的UBA(Ubiquitin-associated)結(jié)構(gòu)域。N端的PB1結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)p62寡聚化以及與其它含PB1結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用。UBA結(jié)構(gòu)域?qū)τ诠丫刍膒62形成蛋白聚集體是必須的，特別是當(dāng)細(xì)胞暴露于氧化環(huán)境中，其作為信號(hào)組織中心負(fù)責(zé)招募泛素化修飾的蛋白底物。作為支架蛋白，p62通過(guò)其UBA結(jié)構(gòu)域與蛋白聚集體(protein aggregate)相結(jié)合并將其導(dǎo)向自噬體從而將其降解。LIR結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)富含酸性氨基酸和疏水氨基酸的簇(DDD和WxxL)，該酸性簇和LIR結(jié)構(gòu)域的其它兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸Trp338/Leu341可與LC3蛋白中的多個(gè)位點(diǎn) (N端的堿性氨基酸以及LC3的ubiquitin fold表面的兩個(gè)疏水口袋)相互作用。LIR結(jié)構(gòu)域與Atg8/LC3的相互作用負(fù)責(zé)引導(dǎo)泛素化的蛋白到蛋白酶體(proteasome)或自噬體中降解。p62與LC3的熒光共定位和在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)過(guò)程中被一起沉淀(pull down)，說(shuō)明它們參與了自噬過(guò)程中同一蛋白復(fù)合物的形成。在自噬起始的時(shí)候，p62與蛋白聚集體的復(fù)合物與LC3在自噬體的表面相結(jié)合，進(jìn)而起始了蛋白聚集體的降解過(guò)程。p62與LC3蛋白的相互作用對(duì)于p62自身的自噬降解也是必須的，抑制自噬將導(dǎo)致p62的大量堆積，然后形成p62和泛素染色陽(yáng)性的聚集體。Caspase-8被報(bào)道與p62相互作用，從而起始非死亡受體依賴(lài)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。p62的功能異常與人類(lèi)的多種疾病緊密相關(guān)，在肝功能紊亂，腫瘤和多種神經(jīng)退行性疾病的病人樣品中發(fā)現(xiàn)了異常堆積的p62聚集體。p62是蛋白聚集物(protein aggregates)中的常見(jiàn)組分，例如帕金森氏病(Parkinson disease)中的Lewy body，艾滋海默病(Alzheimer's disease)的神經(jīng)纖維纏節(jié)(neurofibrillary tangles)，Huntingtin disease病人的huntingtin aggregates中均含有p62。在佩吉特氏骨病(Paget's disease of bone)，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥 (amyotrophic lateral sclerosis)以及額顳葉變性(frontotemporal lobar degeneration)等疾病中都有p62的突變被報(bào)道。
自噬(Autophagy)是一種在進(jìn)化上高度保守的通過(guò)溶酶體吞噬并降解部分自身組分的細(xì)胞內(nèi)分解代謝途徑。自噬與多種生理功能有關(guān)，在饑餓等不利的環(huán)境條件下，細(xì)胞通過(guò)自噬降解多余或異常的細(xì)胞內(nèi)組分，為細(xì)胞的生存提供能量及原材料，促進(jìn)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化及對(duì)環(huán)境變化產(chǎn)生應(yīng)答。自噬異常與多種病理過(guò)程如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病、病原體感染等都有密切關(guān)系。由于細(xì)胞自噬在生理和病理過(guò)程中都有重要作用，自噬已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。
在用pCMV-GFP-p62轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，熒光顯微鏡下GFP-p62通常以綠色點(diǎn)狀 (puncta)或較為彌散的斑塊狀(speckles)熒光存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。在自噬被抑制的情況下，這種綠色的點(diǎn)狀或斑塊狀物其大小會(huì)變大而且數(shù)目會(huì)變多。p62的熒光標(biāo)記對(duì)于自噬的誘導(dǎo)、自噬的抑制以及蛋白聚集體的清除都是一個(gè)非常好的研究工具。
pCMV-GFP-p62質(zhì)粒的主要信息如下：

pCMV-GFP-p62質(zhì)粒(6349bp)的圖譜如下：

pCMV-GFP-p62表達(dá)基因的詳細(xì)圖譜如下：

pCMV-GFP-p62中沒(méi)有的酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that do not cut pCMV-GFP-p62)包括：

pCMV-GFP-p62中的單酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that cut pCMV-GFP-p62 once)包括：

pCMV-GFP-p62質(zhì)粒中推薦使用的測(cè)序引物序列如下：
T3 primer(620-639): 5´-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3´
T7 primer (2851-2872): 5´-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3´
pCMV-GFP-p62的全序列信息請(qǐng)參考信裕生物網(wǎng)站上該質(zhì)粒的信息。
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