Hot-Start Taq DNA Polymerase

信裕生物生產(chǎn)的Hot-Start Taq DNA Polymerase是一種僅當溫度高于45℃時才具有DNA聚合酶活性的Taq DNA Polymerase(簡稱Taq酶)與其可逆抑制劑的混合物，俗稱熱啟動Taq酶或HS Taq酶。使用本產(chǎn)品進行PCR反應(yīng)時可以在室溫操作，并能有效避免室溫操作時由于普通Taq酶或其它耐熱DNA聚合酶存在活性而導(dǎo)致的非特異性PCR背景。
信裕生物的Hot-Start Taq DNA Polymerase是Taq酶與其可逆性抑制劑的混合物。該抑制劑可以可逆性地結(jié)合于Taq酶活性位點，當溫度低于45℃時，形成非活性的Taq酶和抑制劑的復(fù)合物，從而抑制了Taq酶的活性。在常規(guī)PCR反應(yīng)過程中，當溫度升高至45℃或以上時，Taq酶和其可逆性抑制劑解離，從而發(fā)揮其正常的DNA聚合酶活性。上述機制使Hot-Start Taq DNA 
Polymerase僅在加熱到45℃或以上時才會有酶活性，從而確保了小于45℃時不會發(fā)生非特異性的DNA聚合反應(yīng)，有效降低了PCR的非特異性背景，提高了PCR反應(yīng)的準確性和精確性。
常規(guī)的DNA分離純化操作，例如PCR純化試劑盒或DNA凝膠回收試劑盒和乙醇沉淀等操作，都能有效去除本產(chǎn)品中的抑制劑，以避免可能的對于后續(xù)反應(yīng)的干擾。
Hot-Start Taq DNA Polymerase使用時無需額外的高溫孵育步驟以釋放Taq酶活性。
Hot-Start Taq DNA Polymerase和普通的Taq DNA Polymerase一樣，可以催化5'至3'方向的依賴于DNA模板的DNA的聚合反應(yīng)，沒有3'至5'的外切酶活性，最終會導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的3'末端產(chǎn)生3'-dA overhangs，即產(chǎn)生帶一個A的3'粘端，可直接用于TA克隆。

圖1. Hot-Start Taq DNA Polymerase的酶活力測定。A. Hot-Start Taq DNA Polymerase (HS Taq)在40℃時，其聚合酶活力完全被抑制。以M13 mp18 ssDNA (7249nt，電泳顯示約2.2kb)為模板，添加適量引物后40℃孵育10min，1% Agarose凝膠電泳。圖中可見普通Taq酶在40℃可以發(fā)生聚合反應(yīng)，使DNA條帶延長至電泳呈現(xiàn)的約3.5kb大小，而Hot-Start Taq酶(HS Taq)完全不能使M13 mp18 ssDNA的鏈發(fā)生延長，即其酶活力完全被抑制。B. Hot-Start Taq DNA Polymerase在常規(guī)PCR條件下其活力完全被釋放，PCR擴增效果和Taq酶完全一致。

來源：本產(chǎn)品使用的Taq DNA Polymerase為recombinant Taq DNA Polymerase，通過大腸桿菌表達純化獲得，和純化獲得的天然Taq DNA Polymerase在各方面的性質(zhì)相同。
用途：高背景和有非特異性條帶的PCR，高專一性PCR(high-specificity PCR)，高靈敏度PCR，生物芯片分析(microarray
analysis)，常規(guī)PCR，克隆PCR、TA克隆等，不建議用于熒光定量PCR (qPCR)。
活性定義：One unit of the enzyme catalyzes the incorporation of 10 nmol of deoxyribonucleotides into a
polynucleotide fraction (adsorbed on DE-81) in 30 min at 70℃. Enzyme activity is assayed in the following mixture: 67
mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃), 6.7 mM MgCl₂, 1 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NaCl, 0.1 mg/ml BSA, 0.75 mM
activated calf thymus DNA, 0.2 mM of each dNTP, 0.4 MBq/ml [³H]dTTP。
純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，滿足常規(guī)PCR反應(yīng)要求。
酶儲存溶液：20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.5% (v/v) Nonidet P40, 0.5% (v/v)
Tween 20 and 50% (v/v) glycerol。
10X Hot-Start PCR Buffer：100 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃), 500 mM KCl, 15mM MgCl₂, 0.8% (v/v) Nonidet
P40。
失活或抑制：酚氯仿抽提可以使Hot-Start Taq DNA Polymerase失活，加入脫氧膽酸鈉至0.06%，SDS至0.01%，或
sarkosyl至0.02%均可以抑制Hot-Start Taq DNA Polymerase。
本產(chǎn)品用于50微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于160個反應(yīng)；用于20微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于400個反應(yīng)。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項： 
由于PCR反應(yīng)非常靈敏可以擴增目的基因序列超過1000萬倍，在使用Hot-Start Taq Polymerase時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對照以確認是否有待擴增DNA的污染。
Hot-Start Taq DNA Polymerase在PCR過程中每循環(huán)的出錯幾率約為2.2×10^-5，對于大于1kb的DNA片段的克隆推薦使用出錯幾率更低的DNA聚合酶，例如Pfu DNA Polymerase、BeyoTaq DNA Polymerase等。對于普通的PCR或RT-PCR定性檢測或定量檢測，Hot-Start Taq DNA Polymerase是選擇。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：

• 1.PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
  • a.融解并混勻PCR反應(yīng)所需的各種溶液。將Hot-Start Taq DNA Polymerase置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
  • b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)體系(如果有多個類似的PCR反應(yīng)，可以先配制大體積的包含水、buffer、dNTP和Hot-Start Taq酶的混合物，然后分裝到各PCR反應(yīng)管內(nèi)。根據(jù)情況，有時混合物中可以包括引物)：
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    ▲

    試劑

    最終濃度

    體積

    雙蒸水或Milli-Q水

    -

    (36.5-x)μl

    10X Hot-Start PCR Buffer

    1X

    5μl

    dNTP (2.5mM each)

    0.2mM each

    4μl

    模板DNA

    10pg-1μg*

    xμl

    引物混合物(10μM each)

    0.8μM

    4μl

    Hot-Start Taq DNA Polymerase (2.5U/μl)

    1.25U/50μl

    0.5μl

    總體積

    -

    50μl
    • 注意：(a)通常引物的終濃度為0.2μM時可獲得良好的檢測效果，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時，可降低引物濃度。
    •           (b)對于不同類型的模板在50μl反應(yīng)體積中推薦用量如下：哺乳動物基因組DNA：0.1-1μg；大腸桿菌基因組DNA：10-100ng；質(zhì)粒DNA：0.1-10ng。過多的模板DNA容易導(dǎo)致非特異性的PCR產(chǎn)物。
  • c. 用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
  • d. 如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(mineral oil，ST275)。
  • e. 把設(shè)置好的PCR反應(yīng)體系置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
• 2. PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：
  • STEP1(起始變性): 94℃ 3min
  • STEP2(變性): 94℃ 30sec
  • STEP3(退火): 55℃ 30sec
  • STEP4(延伸): 72℃ 1min
  • STEP5(循環(huán)): Go To STEP2 for 30 cycles
  • STEP6(最終延伸): 72℃ 10min
  • STEP7(臨時保存): 4℃ forever
• 注意：
  • a.PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長度和GC含量等條件的不同設(shè)定不同的PCR反應(yīng)條件包括溫度、時間和循環(huán)數(shù)等。
  • b.STEP4(延伸)的時間設(shè)置需根據(jù)PCR產(chǎn)物的長度進行設(shè)置，通常每kb產(chǎn)物的延伸時間為1分鐘。例如PCR產(chǎn)物的長度為1kb，則延伸時間可以設(shè)置為1分鐘，PCR產(chǎn)物的長度為2kb，則延伸時間可以設(shè)置為2分鐘，以此類推。
  • c.對于初次進行的PCR，為盡量確?？梢詳U增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。對于需進行半定量反應(yīng)循環(huán)數(shù)一定要進行適當優(yōu)化，使PCR反應(yīng)沒有達到平臺期。

常見問題：

• 1.PCR產(chǎn)物非常少或沒有特異性條帶。
  • a.引物設(shè)計不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當?shù)囊镌O(shè)計軟件進行引物設(shè)計，注意引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點等的引物中，一定要注意加入酶切位點等后整條引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
  • b.待擴增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時可以使用適合擴增高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。
  • c.長片段擴增。盡管Hot-Start Taq DNA Polymerase可以擴增最長達8kb的DNA片段，但大多數(shù)時候比較適合擴增3kb以下的片段，更長片段的擴增推薦使用其它更適合長片段擴增的DNA聚合酶。
  • d.PCR反應(yīng)設(shè)置時在室溫進行容易導(dǎo)致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
  • e.由于引物存在一定的二級結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導(dǎo)致退火效果不佳。此時可以采用Touch down等方法進行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
  • f.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索的退火溫度。
  • g.延伸時間不足?？砂凑彰?kb片段延伸1分鐘進行設(shè)置，對于較難擴增的片段可以設(shè)置為每1kb片段延伸1.5-2分鐘。
  • h.待擴增片段GC含量較高或長度較長，變性不夠充分?？梢哉{(diào)節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
  • i.在不同PCR儀上進行PCR反應(yīng)，避免有時PCR儀出現(xiàn)問題。
  • j.循環(huán)數(shù)不足，適當延長PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
  • k.模板含量太低，適當加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設(shè)計的PCR引物內(nèi)側(cè)再設(shè)計一對PCR引物，然后對次PCR產(chǎn)物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，這樣一方面可以起到擴增作用，同時也可以從次PCR產(chǎn)物中擴增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡單地用原有引物對次PCR產(chǎn)物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，可以起到擴增作用，但不能去除非特異性條帶。
  • l.模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
  • m.當產(chǎn)生較多非特異性條帶時，可以適當提高退火溫度。
  • n.注意設(shè)置適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ胀ǔ泻艽髱椭?/li>