BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase

信裕生物生產(chǎn)的BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase，是一種通過基因重組改造而獲得的具有超強(4kb/min)、超長(35kb)擴增能力的高度熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，具有擴增速度極快，保真度極高，短時間內(nèi)即可輕松實現(xiàn)35kb λDNA片段擴增等突出優(yōu)點(參考圖1)。推薦用于5kb甚至30kb以上長片段的PCR擴增。
BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase使用單體酶完成超長片段擴增。同類產(chǎn)品如NEB的LongAmp^® Taq DNA Polymerase、Thermo的Scientific Extensor Long Range PCR Enzyme Mix、Promega的GoTaq^® Long PCR Master Mix等進行超長片段擴增大多采用雙酶體系，即結(jié)合具有強擴增能力的DNA聚合酶和具有校對功能的DNA聚合酶來實現(xiàn)保真性高的長片段擴增，而BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase和Thermo的GeneAmp^® XL PCR Kit中使用的rTth DNA Polymerase XL (Extra Long)類似，不需要任何其它酶或者蛋白、多肽等輔助因子，即可突破單體酶一步完成長片段的擴增。
BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase擴增速度極快。擴增小于6kb的DNA片段時，延伸每1kb只需要15秒；擴增大于6kb的DNA片段時，延伸每1kb也只需要30秒。BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase由于其超快的擴增速度，因而可以大大縮短超長片段每個PCR循環(huán)的擴增時間。本產(chǎn)品也同樣適用于短片段的擴增，可以實現(xiàn)超快速的PCR擴增。
BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase是一種高保真DNA聚合酶。它不僅可以非常高效地催化5'至3'方向的依賴于DNA模板的脫氧核苷酸的聚合反應，它同時還具有3'至5'的外切酶活性(proofreading activity)，它的錯誤發(fā)生概率比Taq酶要低100倍，比pfu酶還要低約9倍。它可以輕松勝任具有復雜二級結(jié)構(gòu)的、非常長的DNA片段的準確擴增，因此它是目的基因擴增和克隆的理想選擇。
圖1. BeyoAmp™ Extra-long DNA polymerase以λDNA為模板，PCR擴增不同長度片段(5-35kb)的電泳圖。電泳采用0.8%瓊脂糖凝膠，1XTAE，100V電泳180分鐘。
BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase的主要性能與Taq酶及同類產(chǎn)品的比較請參考下表。

來源：BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase通過大腸桿菌重組、表達、純化而獲得。
用途：超長DNA片段的準確高效PCR擴增、常規(guī)高保真PCR、點突變、克隆用途的PCR擴增等。BeyoAmp™ Extra-long DNA polymerase擴增出來的DNA片段為雙平端，可以直接用于雙平端克隆，但不能直接用于常規(guī)的T載體克隆。如需用于T載體克隆，推薦選購BeyoFusion™ Plus DNA polymerase。
活性定義：One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate 10 nmol of dNTP into acid insoluble material in 30 minutes at 74℃.
純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，滿足常規(guī)PCR反應要求。
酶儲存溶液：20mM Tris-HCl (pH 7.5), 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 100mM KCl, 200µg/ml BSA and 50% (v/v) glycerol。
失活或抑制：酚抽提可以使BeyoAmp™ Extra-long DNA polymerase失活。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項：
PCR反應非常靈敏，在使用BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase進行PCR擴增反應時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量設置不加模板的空白對照。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
 

使用說明：
1.PCR反應體系的設置：
a.溶解并混勻PCR反應所需的各種溶液。將BeyoAmp™ Extra-long DNA polymerase置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
b.參考下表在冰浴上設置PCR反應(如果有多個類似的PCR反應，可以先配制大體積的包含水、buffer、dNTP和BeyoAmp™ Extra-long DNA polymerase的混合物，然后分裝到各PCR反應管內(nèi)。根據(jù)情況，有時混合物中可以包括引物)：

*對于不同類型模板DNA的推薦用量如下：哺乳動物基因組DNA 100ng-500ng；大腸桿菌基因組DNA 100pg-100ng；質(zhì)粒DNA 1ng-20ng。擴增大于25kb的片段時，模板量宜適當加大，但過多的模板DNA也容易導致非特異性的PCR產(chǎn)物。
c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果用的PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(ST275 Mineral oil (礦物油))以防止蒸發(fā)。
e.各設置好的PCR反應管置于PCR儀上，開始PCR反應。
2.PCR反應參數(shù)的設置可以參考如下表格：

說明：上面表格中15sec/kb表示，如果擴增片段是4kb，那么68℃的延伸時間為1分鐘。0.5min/kb表示如果擴增片段是4kb，那么68℃的延伸時間為2分鐘。*對于大于25kb的長片段PCR，建議采用兩步法，將退火/延伸溫度合并為68℃，可顯著提高擴增特異性。
a.最初變性和變性的溫度設置為94℃，延伸溫度設置為72℃，其余條件不變時，都可以進行正常的PCR擴增，但擴增效果會稍有下降。對于較難擴增的序列，推薦使用92℃變性和72℃延長。
b.PCR反應的設置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長度和GC含量等條件的不同設定不同的變性、退火和延伸的溫度和時間以及循環(huán)數(shù)等。
c.對于初次進行的PCR，為盡量確?？梢詳U增出預期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設置為35。對于需進行半定量或定量的PCR反應，循環(huán)數(shù)需要進行適當優(yōu)化，使PCR反應沒有達到平臺期。

常見問題：
1.PCR產(chǎn)物非常少或沒有特異性條帶。
a.引物設計不佳是PCR過程中最常見的問題。請選擇適當?shù)囊镌O計軟件進行引物設計，注意引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點等的引物中，一定要注意加入酶切位點等后整條引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
b.待擴增片斷GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時可以使用適合擴增高GC含量DNA片斷的GC-rich buffer，并相應地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調(diào)整PCR反應參數(shù)的設置。直接添加1-10%DMSO或5-20%甘油對于擴增高GC含量的片段也有幫助。
c.PCR反應設置時在室溫進行容易導致非特異性條件。推薦在冰浴上設置PCR反應。
d.由于引物存在一定的二級結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導致退火效果不佳。此時可以采用Touch down等方法進行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55或50℃的方法，使退火更加充分。
e.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設置退火的溫度梯度，摸索退火的溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應摸索的退火溫度。
f.延伸時間不足?？梢栽谕扑]的延伸時間基礎上把延伸時間延長2-5倍，對于較難擴增的片斷可以設置為每1kb延伸1分鐘。
g.待擴增片斷GC含量較高或長度較長，變性不夠充分?？梢哉{(diào)節(jié)起始變性條件至94℃ 2-4min甚至94℃ 5min。
h.在不同PCR儀上進行PCR反應，避免有時PCR儀出現(xiàn)問題。
i.循環(huán)數(shù)不足，適當延長PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
j.模板含量太低，適當加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設計的PCR引物內(nèi)側(cè)再設計一對PCR引物，然后對次PCR產(chǎn)物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，這樣一方面可以起到擴增作用，同時也可以從次PCR產(chǎn)物中擴增出特異性條帶。二次PCR則為比較簡單地用原有引物對次PCR產(chǎn)物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，可以起到擴增作用，但不能去除非特異性條帶。
k.模板中含有抑制PCR反應的物質(zhì)，可以用適當?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
l.對PCR引物進行脫鹽純化。
m.使用高質(zhì)量的dNTP混合物。
n.適當增加DNA polymerase的用量。
o.當產(chǎn)生較多非特異性條帶時，可以適當提高退火溫度。
p.注意設置適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ胀ǔ泻艽髱椭?br /> q.使用完整、高純度、高質(zhì)量的DNA模板，且避免模板反復凍融。長片段DNA反復凍融過程中可能會出現(xiàn)斷裂的問題。
r.Mg²⁺濃度較低，或Mg²⁺與dNTP的比例不合適。使用本產(chǎn)品中提供的緩沖液就無需擔心鎂離子濃度的問題。
s.根據(jù)片段大小選擇合適的瓊脂糖凝膠濃度和電泳條件。大片段DNA的電泳需要使用低濃度的瓊脂糖凝膠和較低的電泳電壓，并電泳較長的電泳時間。
t.PCR反應體系中有氣泡或者溶液蒸發(fā)。
2.雜帶較多或條帶彌散
a.退火溫度提高2-5℃。
b.減少DNA模板的用量。
c.PCR反應設置時在室溫進行容易產(chǎn)生非特異性條帶。推薦在冰浴上設置PCR反應。
d.適當減少BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase的用量。
e.適當縮短延伸時間。