??????碧云天生產(chǎn)的Seamless Cloning Kit(無縫克隆試劑盒)是一種新型的基于插入片段和線性化載體的末端進行同源重組的基因克隆試劑盒。本試劑盒利用包含了DNA 5' 外切酶(5' Exonuclease)、DNA聚合酶(DNA Polymerase)和DNA連接酶(DNA
Ligase)活性的重組酶(assembly enzyme)，通過同源重組的方法可以將一個或多個DNA片段按照預(yù)定方向、快速、高效和精確
地插入到線性化載體中，并且最終構(gòu)建的克隆沒有任何額外的堿基序列，因此被稱作“無縫克隆”。
??????和傳統(tǒng)的基因克隆方法相比，本試劑盒的無縫克隆方法有多方面的突出優(yōu)點：(1)?最終構(gòu)建的克隆沒有任何額外的堿基序列，因此是真正的"無縫克隆"；(2)?可通過一個反應(yīng)將一個或多個片段快速、定向地插入到載體的任何位置；(3)?待插入的PCR擴增產(chǎn)物無須酶切；(4)?插入片段的大小范圍寬，從20bp左右的小片段到10kb左右的大片段都可以成功插入；(5)?可通過PCR擴增獲得線性化載體，因此限制性內(nèi)切酶消化并不是克隆所必須的；(6)?酶催化的重組連接反應(yīng)非常快速和高效，對于一個片段的插入僅需50℃處理15分鐘；對于三個片段的插入僅需50℃處理30分鐘，而對于5個片段的插入也僅需50℃處理約60分鐘；(7)?只有插入片段和線性化載體的末端才能發(fā)生同源重組，可以有效避免非特異性的同源重組；(8)?陽性克隆比例高，單個DNA片段克隆的陽性率幾乎為100%，三個片段的克隆陽性率約為70-80%。
??????本無縫克隆試劑盒操作非常簡單。本試劑盒進行基因克隆時沒有酶切位點的限制，僅需在載體的預(yù)定克隆位點通過酶切進行線性化或通過PCR的方法直接制備線性化的載體，在插入片段的兩個PCR引物的5' 端引入與載體克隆位點兩端完全一致的
15~25bp的重疊序列。重組反應(yīng)可以在50℃快速進行，3-4小時內(nèi)即可完成從DNA樣品的PCR擴增、純化、重組、到轉(zhuǎn)化涂板的全部操作。其中PCR反應(yīng)約2-3小時，PCR產(chǎn)物純化約20分鐘，重組反應(yīng)15分鐘，轉(zhuǎn)化涂板約40分鐘，共計約3-4小時即可完成。
??????碧云天無縫克隆試劑盒的工作原理示意圖請參考圖1。

?????? 圖1. 碧云天無縫克隆試劑盒的工作原理圖。重疊區(qū)域(overlap region)的DNA序列完全一致，通常長度為15-25bp。不同顏
色的重疊區(qū)域代表不同的重疊序列。在插入2個或以上片段時，不同的重疊序列可以確保待插入片段有序地插入到線性化的載體(linearized vector)中。
??????本試劑盒用于一個1100bp片段的克隆和三個不同的1100bp片段的克隆，其重組反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂板獲得的LB平板的實測效果參考圖2A，菌落PCR鑒定結(jié)果參考圖2B。

??????圖2. 本試劑盒用于無縫克隆的實測效果。A. 本試劑盒反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α后涂板獲得的LB平板效果圖。在20μl反應(yīng)體系中，將雙酶切線性化的載體pUC18 (Linearized pUC18)，與通過PCR擴增的含有重疊序列的插入片段(DNA fragment, 1100bp)混合(pUC18載體與PCR片段的摩爾比為1:3)；或者與3個有適當(dāng)重疊序列的不同的1100bp片段混合，pUC18載體與PCR片段的摩爾比為1:1:1:1，然后加入10μl的2X Seamless Cloning Mix，并用水補至20μl，50℃反應(yīng)15min(插入一個片段)或
30min(插入三個片段)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物放置在冰上5min，取5μl轉(zhuǎn)化到100μl的DH5α感受態(tài)細(xì)菌中。對照組中只加入線性化的載體pUC18，同時也在50℃反應(yīng)15min。實驗結(jié)果表明，插入片段數(shù)目越多轉(zhuǎn)化后得到的克隆數(shù)越少。B.菌落PCR鑒定用本試劑盒構(gòu)建得到的克隆。實驗結(jié)果表明，插入1個片段時的陽性率基本上為100%，插入3個片段時的陽性率約為70%左右。
包裝清單：

保存條件：
??????-20℃保存，一年有效。
注意事項：
??????單個片段的PCR產(chǎn)物進行重組反應(yīng)時，如果PCR條帶單一，可以無須純化并直接進行重組反應(yīng)，但PCR產(chǎn)物的體積不得超過重組反應(yīng)體系的20%，并且重組效率通常會低于純化后的PCR產(chǎn)物。
??????對于多個片段的重組反應(yīng)，重組效率通常會低于單個片段的重組效率，建議膠回收純化后再進行重組反應(yīng)。對于3個以上片段的重組反應(yīng)或重組片段大于5kb時，強烈建議在膠回收后再進行重組反應(yīng)。通常膠回收后，重組效率可提高2-10倍。
??????單片段和線性化載體重組時，摩爾比至少為2:1。多片段和線性化載體重組時，各個片段和線性化載體的摩爾數(shù)宜保持一致。
??????本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
??????為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。