植物線粒體純化試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn)植物線粒體是重要的植物細(xì)胞器，負(fù)責(zé) ATP 的產(chǎn)生。此外植物很多重要的特性(如 雄性不育)也跟線粒體相關(guān)，是母系遺傳研究的重要材料。對(duì)植物線粒體進(jìn)行生化和遺 傳研究都需要進(jìn)行線粒體純化。本產(chǎn)品就是專門用于植物細(xì)胞線粒體純化的試劑盒， 它具有下列特點(diǎn)：

1. 即用型試劑盒，用戶不需要單獨(dú)配制各種溶液。

2. 提供粗提和精提兩種操作方案，粗提利用常規(guī)臺(tái)式冷凍離心機(jī)的差速分離原理進(jìn) 行線粒體粗提，所得線粒體含少量其他細(xì)胞器污染，可用于后續(xù)的 SDS-PAGE， Western，ELSIA 和蛋白組分析，也可以用于 PCR 級(jí)別的線粒體 DNA 和 RNA 提取。

3. 精提利用冷凍超速離心（離心力達(dá) 40000g）制備的密度梯度來(lái)將粗提制備的線 粒體和其他細(xì)胞成分進(jìn)一步分開，得到線粒體精提液，適用于后續(xù)的偶聯(lián)分析、 體 外 線 粒 體 蛋 白 合 成 、 線 粒 體 成 份 定 位 等 精 細(xì) 實(shí) 驗(yàn) 。 也 可 用 于 后 續(xù) 的 SDS-PAGE、Western、ELSIA、蛋白組分析和測(cè)序級(jí)別的線粒體 DNA 和 RNA 提取。

4. 本產(chǎn)品足夠 5 次提取，每次可處理 10g 綠色植物組織（可得 1-2.5 mg 左右線粒 體）或 20g 非綠色植物組織（可得 2-5 mg 左右的線粒體）。
規(guī)格及成分 成 分 編號(hào) 大紙盒包裝
勻漿液 LM111208A 250 mL
洗滌液 LM111208B 250 mL×2
離心介質(zhì)溶液 111208C 150 mL
Percoll 17-0891-09 50 mL
BSA 干粉 9048-46-8 10g
帶柄尼龍篩 --- 1 只
軟毛筆 --- 1 只
使用手冊(cè) 111208sc 1 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存, 保存期限一年。

自備試劑 超純水，可能需要 5 M KOH 調(diào) pH，如果需要去除細(xì)胞核 DNA，還需要自備 25mM MgCl2溶液、0.5M EDTA 溶液、DNase 干粉和另購(gòu)更多洗滌液。

使用方法 注意：線粒體膜對(duì)溫度高度敏感，所以整個(gè)操作必須在冰上或者在冷室進(jìn)行，所用植 物組織，器皿和溶液均需要在 4℃預(yù)冷。任何情況下線粒體的溫度都不要超過 4℃。

一：選擇組織

1. 植物組織不同，線粒體產(chǎn)率不同，請(qǐng)以下表為參考：植物組織種類 線粒體產(chǎn)率 說(shuō)明根和塊莖 0.3 mg/10g 如土豆，紅薯等黃化苗（下胚軸、子葉、胚芽鞘） 2-5 mg/10g 多酚含量低于葉片有光合作用的葉片和子葉 1-2.5 mg/10g 需放置在暗處 3 天

2. 一般純化好選用用黃化苗。如果用綠色組織（如葉片），需將植物提前放在暗室至少 3 天以降低淀粉含量，否則淀粉顆粒將干擾線粒體的純化。

3. 一次實(shí)驗(yàn)需要 40 mL 勻漿液、約 90 mL 洗滌液和 35 mL 密度梯度離心介質(zhì)（配制方式是一次性將 9.8g (8.7mL) Percoll 加入到 26.3mL 離心介質(zhì)溶液中，充分混勻后得到 35mL 密度梯度離心介質(zhì)）。這三種溶液用前均需要加入 BSA 干粉使其終濃度為 0.1%（100mL 溶液加 0.1g BSA 干粉，輕柔顛倒混勻或攪拌溶解后放冰上預(yù)冷待用）。每次實(shí)驗(yàn)用多少配多少，不要預(yù)先將所有 BSA 干粉加入，否則容易長(zhǎng)菌。

二：線粒體粗提操作流程

1. 將 10 g 的綠色植物組織（如去葉脈后的嫩葉子，愈傷組織）或 20 g 干凈的非綠色植物組織（如發(fā)芽組織、根、塊莖等）浸泡在冰水中 10 分鐘，用紙吸干液體后浸泡在預(yù)冷的 40 mL 勻漿液（需先加 0.1% BSA）中，在浸泡狀態(tài)下剪成 1cm2大小的碎片。注意：如果樣品可分成多組平行處理，得到線粒體粗提物后再匯集，否則線粒體產(chǎn)率將急劇降低。

2. 將勻漿液和其中的植物組織碎片轉(zhuǎn)移到 Waring 勻漿器中，中速勻漿 3 次，每次15 秒，每次之間間隔 10 秒以便讓碎片沉淀下來(lái)到刀片處。也可使用研磨法。具體操作是將勻漿液和其中的植物組織碎片轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的研缽中，研磨 3-4 分鐘。

注意：植物組織勻漿后釋放的物質(zhì)會(huì)使勻漿液酸化，降低 pH，而線粒體對(duì) pH變化非常敏感，因此建議勻漿后用 pH 試紙檢測(cè)勻漿液的 pH，如果低于 7.0，必須用自備的 5 M KOH 將 pH 調(diào)到 7.0 以上才進(jìn)入下一步。

3. 用帶柄尼龍篩過濾勻漿液，穿透液可通過預(yù)冷的漏斗收集到預(yù)冷的 50 mL 的塑料離心管中。帶柄尼龍篩可以洗干凈后可以反復(fù)使用。

4. 在低速固定角度冷凍離心機(jī)上 4℃ 1000 g 離心 5 分鐘，沉淀為未破碎的細(xì)胞、破碎細(xì)胞的碎片、細(xì)胞核和淀粉顆粒，上清含線粒體。小心轉(zhuǎn)移上清到新的預(yù)冷的 50mL 塑料離心管中。

5. 將裝上清的離心管在水平冷凍離心機(jī)上 4℃ 12,000 g 離心 20 分鐘，棄上清液，所得棕綠色沉淀即為純化的線粒體粗提物。有時(shí)沉淀底部還有白色的淀粉沉淀，屬于正常現(xiàn)象。

6. 加入 10 mL 預(yù)冷的洗滌液（需先加 0.1% BSA，下同）中，用軟毛筆輕柔重懸線粒體沉淀(如果底下有白色淀粉沉淀，需要避免重懸之)。不能劇烈震蕩，否則線粒體容易破裂。

7. 將線粒體重懸液轉(zhuǎn)移到新的 50mL 離心管中，再加入 30mL 預(yù)冷的洗滌液（終體積為 40 mL）中，4℃ 1000 g 離心 5 分鐘。線粒體將在上清中。

8. 將上清轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷的 50mL 離心管中，4℃ 12000 g 離心 20 分鐘，沉淀為線粒體。小心棄上清。到此步時(shí)，線粒體回收率一般在 15-30%。

9. 在沉淀中加入 2 mL 預(yù)冷的洗滌液。用軟毛筆輕柔重懸，得到線粒體粗提液。如果有平行提取，可將最多 4 管線粒體沉淀重懸在 2 mL 洗滌液中。線粒體粗提液中線粒體的回收率一般在 45-75%。

10. 所得線粒體粗提液含其他細(xì)胞器（如類囊體膜, 質(zhì)體, 過氧化物酶體， 乙醛酸循環(huán)體,或細(xì)菌）污染，但可直接用于 PCR 級(jí)線粒體 DNA 和 RNA 的提取、呼吸鏈功能測(cè)定、蛋白濃度測(cè)定和線粒體精提。如果需要長(zhǎng)期保存，則可以在線粒體重懸液中加入 1/20 體積的自備 DMSO，混勻后分成 0.5 mL/管，然后放-80℃保存。如此保存的線粒體酶活性和膜完整性在幾年內(nèi)都不會(huì)發(fā)生變化。

三：細(xì)胞核 DNA 的去除（純化測(cè)序級(jí)的線粒體 DNA 才需要進(jìn)行此操作。本產(chǎn)品不

提供相關(guān)試劑，實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考）

11. 預(yù)留 50uL 線粒體粗提液做對(duì)照，在約 2 mL 剩余的線粒體粗提液中加入 40 uL25mM 的 MgC

l2，再加入 200ug DNase 干粉或溶液（總量為 200ug 即可），混勻后冰上放置 60 分鐘降解 DNA。取

13. 4℃ 1000 g 離心 5 分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷的 50mL 離心管中，4℃ 12000g 離心 20 分鐘，沉淀為去除細(xì)胞核 DNA 的線粒體。重懸在 2mL 洗滌液中。四：線粒體精提操作方案（需要 40000g 的超速冷凍離心機(jī)）

14. 在 50 mL 預(yù)冷的塑料離心管中先后加入 35 mL 預(yù)冷的密度梯度離心介質(zhì)（配制

方法見第三步，用前需先加 0.1% BSA）。

15. 將 2 mL 線粒體粗提物重懸液鋪在密度梯度離心介質(zhì)上。

16. 在超速水平離心機(jī)上 4℃ 40,000 g 離心 45 分鐘，最上層為黃色或橙色的質(zhì)體帶（如果材料是綠色植物，此帶將是綠色），其下的白色不透明的帶即為線粒體，管底沉淀為過氧化物酶體。其示意圖如下：

17. 用廣口吸管（可將 1 mL 藍(lán)搶頭中間剪斷后使用）收集線粒體帶，注意避開其上的質(zhì)體帶過氧化物酶體沉淀，估計(jì)所取含線粒體溶液的體積。

18. 在 15-20 分鐘的時(shí)間內(nèi)緩慢加入至少 4 倍體積的預(yù)冷的洗滌液。

19. 轉(zhuǎn)入 50 mL 塑料管離心管中，在冷凍離心機(jī)上 4℃ 15,000 g 離心 20 分鐘，沉淀為線粒體。

20. 將線粒體沉淀用軟毛筆小心重懸在至少 4 倍體積的預(yù)冷的洗滌液中，在冷凍離心機(jī)上 4℃ 15,000 g 離心 20 分鐘，棄上清，沉淀即為洗滌后的線粒體精提物。到此步時(shí)，線粒體回收率一般在 5-15%。

21. 將精提的線粒體重懸在 1mL 預(yù)冷的洗滌液中。重懸的線粒體可以立即使用，在冰上最多可放置 5-6 小時(shí)。如果需要長(zhǎng)期保存，則可以在線粒體重懸液中加入1/20 體積的 DMSO，混勻后分成 0.5 mL/管，然后放-80℃保存。如此保存線粒體酶活性和膜完整性在幾年內(nèi)都不會(huì)發(fā)生變化。

五：線粒體后續(xù)處理（本產(chǎn)品不提供相關(guān)試劑，實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考）

22. DNA 提取：離心得線粒體沉淀，再按常規(guī)的 SDS-蛋白酶 K 酶解，酚氯仿抽提，乙醇-鹽沉淀的方法制備線粒體 DNA。也可以用細(xì)菌 DNA 提取的試劑盒制備DNA。

23. RNA 提?。弘x心得線粒體沉淀，再按常規(guī)的 Trizol 方法制備線粒體 RNA。

24. 總蛋白提取：按細(xì)菌總蛋白提取方法。

25. 線粒體內(nèi)膜，外膜、基質(zhì)純化：請(qǐng)自備方法。

26. 其他功能檢測(cè)：請(qǐng)自備方法。